非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒云南株的分离鉴定及遗传变异分析

2018年云南省边境地区某猪场猪群出现高热等症状,部分猪只死亡。为确认发病原因,采集死亡猪只肺脏组织样品进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)RT-PCR检测,然后将阳性样品接种Marc-145细胞,连续传代3次后发现产生稳定的细胞病变效应(CPE)。经间接免疫荧光试验(IFA)、毒价测定及病毒全基因组测序,最终确定病原为PRRSV,将其命名为YNML-2018株,毒价测定为10-4.88 TCID50/0.1 mL。全基因组序列分析显示,YNML-2018毒株基因组全长15357 bp,包含8个开放阅读框(ORF),其中非结构蛋白2编码基因(NSP2)缺失90个碱基。病毒全基因组遗传进化分析显示,该毒株序列与国内分离的高致病性PRRSV同源性为95.3%~99.3%;其NSP2高变区序列与国内分离的高致病性PRRSV同源性为92.1%~97.8%;结构蛋白GP3、GP5氨基酸序列与国内分离的高致病性PRRSV毒株同源性分别为84.3%~99.6%和83.1%~99.0%。结果表明,YNML-2018株与近年来我国PRRSV流行株相比存在一定变异,但变异程度较低,仍与首次报道的高致病性毒株JXA1同属于亚群V。本研究为掌握云南省边境地区PRRSV流行毒株的遗传变异特征提供了技术支撑,并可为疫苗选用提供数据参考。

表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的伪狂犬病病毒拯救与纯化

为研制预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗候选毒株,本研究依据HP-PRRSV HuN4毒株GP5基因序列设计并合成1对特异引物,BamHⅠ引入到引物的5′端,从HP-PRRSV毒株的RNA中,用RT-PCR扩增HP-PRRSV GP5基因。将BamHⅠ酶切的PCR产物与同样酶切并去磷酸化的PRV转移载体pG相连接,构建重组质粒pG-GP5/HP-EGFP。采用脂质体转染法将pG-GP5/HP-EGFP质粒转染已接种PRV三基因缺失毒株rPRV-gE^(-)/gI^(-)/TK^(-)的ST细胞中,经病毒空斑纯化,获得携有HP-PRRSV GP5基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的重组伪狂犬病病毒rPRV-GP5/HP-EGFP。将重组病毒rPRV-GP5/HP-EGFP接种CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒转染过的ST细胞,经4轮病毒空斑纯化,最终获得无绿色荧光蛋白的重组病毒rPRV-GP5/HP。经PCR鉴定及测序,证实获得的rPRV-GP5/HP在EGFP基因上缺失了1 232 bp。经RT-PCR和间接免疫荧光试验进一步表明成功构建重组病毒rPRV-GP5/HP。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的以及本实验室分离鉴定的PRRSV的nsp2基因序列,在nsp2缺失区的两端的保守区设计并合成了一对引物,建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法。该方法扩增高致病性PRRSV基因组时可获得230bp的片段,扩增经典型PRRSV时则获得320bp的片段,根据RT-PCR产物大小可将二者区分开来。通过大量临床病料的检测,并配合PCR产物测序验证,结果表明该方法简便、快速、特异,可以鉴别高致病性PRRSV,为进一步的PRRS流行病学研究提供了重要的技术手段。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

2006年6月份以来,我国多个省份暴发高致病性猪繁殖与呼吸综合征,给我国养猪业造成了巨大经济损失。为全面了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在我国的流行情况以及遗传变异规律,本研究采用RT-PCR的方法,对从2006年8月至2007年10月期间,来自于19省(市)共474份样品进行高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸的检测,结果检出阳性样品294份。在各省不同时期样品中均有阳性样品检出。通过对阳性样品进行Nsp2基因和ORF5基因扩增,序列分析发现所有检测的猪繁殖与呼吸综合征病毒株高度同源,为同一毒株遗传变异而来,所有猪繁殖与呼吸综合征毒株与HB-1株遗传关系最近;且Nsp2均缺失30个氨基酸。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株主要囊膜糖蛋白GP5的遗传变异分析

为了探究高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)的遗传变异特征,本研究对GenBank中235株HP-PRRSV GP5序列的遗传进化、主要氨基酸基序、抗原性以及N-糖基化位点数量和位置的变异进行了分析。结果表明HP-PRRSV之间的同源性较高,与其他参考毒株相比,这些病毒处于一个相对独立的分支中,而且与经典疫苗株的亲缘关系较远。这有助于解释经典疫苗株对于HP-PRRSV为何起不到理想的免疫保护效果。在病毒的中和表位序列中存在着规律的点突变,同时抗原性比较显示HP-PRRSV与经典毒株之间存在着一定的差异。绝大多数的HP-PRRSV的N-糖基化位点在数量上多一个,而且位置要向羧基端平移2个氨基酸,从而使得中和表位两侧直接与糖链相连,可能会造成中和表位被糖侧链所遮掩,本研究由此推测减弱中和抗体对HP-PRRSV的有效识别,促进病毒逃避机体体液免疫。

猪α干扰素的原核表达及抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

为了研究高效广谱的基因工程抗病毒制剂,本研究采用PCR技术自猪肝脏总DNA中扩增、克隆猪α干扰素(PoIFN-α)成熟肽基因并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪α干扰素(rPoIFN-α)蛋白通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用细胞病变抑制法分别测定rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗水泡性口炎病毒(VSV)增殖活性及在Marc-145细胞上抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的增殖活性,以分别评价rPoIFN-α的活性单位及其体外抑制高致病性PRRSV增殖所需的最低浓度。结果表明,克隆的PoIFN-α成熟肽基因全长501bp,编码166个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子量大小20.7ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白纯度在95%以上;纯化的rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗VSV病毒活性单位为1.4482×104IU/mL(5.2×106IU/mg),在Marc-145细胞上能完全抑制高致病性PRRSV增殖所需的rPoIFN-α蛋白最低有效剂量为640U/mL(2.3×104U/mg)。这些研究结果为新型基因工程抗病毒制剂的开发以及用于高致病性PRRSV性疾病的预防和治疗奠定了基础。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病和副猪嗜血杆菌病混合感染的诊断与防制

目前在集约化养殖场的猪群中经常出现病毒病和细菌病的混合感染,严重影响中国养猪业的发展。2011年9月,广东某个千头母猪场的猪群大量发病,表现为高热、咳嗽、食欲下降、皮肤发绀、关节肿大等临床症状。通过流行病学调查、剖检、细菌分离鉴定、药敏试验、PCR和RT-PCR等实验室检测最终确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病和副猪嗜血杆菌病的混合感染,在此基础上提出和实施了该病的防控方案。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病RT-PCR快速鉴别诊断方法的建立与临床应用

根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2基因的缺失信息,设计了3条特异性引物,以含高致病性PRRSVNsp2基因的质粒pMDNSP2及普通PRRSVVR2332株RNA为模板,建立了快速诊断高致病性PRRSVRT-PCR方法。通过对临床组织病料的总RNA进行不同稀释倍数检测,结果表明该方法能从0.265pg的总RNA中检测到PRRSV的基因,说明敏感性高。用该方法对猪瘟病毒(CSFV)、Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)、伪狂犬病病毒(PRV)、链球菌(Streptococcus)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)和大肠杆菌(Escherichiacoli)同条件检测,结果都为阴性。进一步对36份疑似高致病性PRRSV临床组织病料细胞培养物、2株PRRSV商品活疫苗以及52个猪场所送检的184份临床样品进行了检测应用,结果36份疑似高致病性PRRSV临床组织病料的细胞培养物有5份样品为阳性且都为高致病性PRRSV,2株PRRSV商品活疫苗为普通PRRSV,52个猪场中有42个猪场(123份样品)呈阳性,其中只有1份为普通PRRSV。实验表明该方法能够准确地鉴别诊断高致病性PRRSV和普通PRRSV,且具有快速、敏感和特异的特点,具有临床实用性。

中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究

【目的】对来自2006年猪病流行爆发地的组织样品进行多种病毒的检测,确定引起本次流行的致病病原及PRRSV的分子流行病学特征。【方法】利用(RT-)PCR对采集的样品进行PRRSV北美型和欧洲型、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)以及瘟病毒的检测,对PRRSV阳性的进行ORF5的序列测定并分析。【结果】检测到16份PRRSV北美型阳性样品,PCV2阳性样品2份,其它病毒均未检到。PRRSV ORF5序列分析表明笔者分离到的PRRSV株可分为2个群。【结论】(1)PRRSV与2006年肆虐中国养猪业的猪病流行有直接关系;(2)2006年PRRSV流行株主要是以JX0612株为代表,但不同遗传特征的PRRSV也在流行。

猪圆环病毒2型感染对高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫应答的影响

采用阻断ELISA法对单独接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征组(hpPRRS,B组)及PCV2人工感染21d后接种hpPRRS疫苗组(PB组)不同时期血清中的PRRSV抗体进行检测,同时对不同时期前腔静脉血进行CD4/CD8流式细胞术及血常规分析。结果表明,在接种后32dB组白细胞含量极显著高于PB组(P<0.01),接种后62dB组淋巴细胞含量极显著高于PB组(P<0.01),接种后75dPB组幼稚型Th细胞含量显著高于B组(P<0.05),接种后32、62及75dB组Tc细胞含量为PB组的2.40、1.98和1.86倍,接种后32、48及62dB组记忆/激活Th细胞含量分别为PB组的1.54、1.46及1.32倍。

不同免疫方式对仔猪免疫高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪口蹄疫三种疫苗抗体水平的影响

采用不同的免疫方式,对38头36~38日龄健康仔猪进行高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪口蹄疫3种疫苗进行免疫,分别于免疫前（0 d）和免疫后15、30、45、60、90 d采血进行这3种疫病抗体检测。结果发现效果最好的方法是先免疫猪瘟和口蹄疫疫苗14 d后再免疫高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗;其次是猪瘟疫苗和高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗分别释稀后混合为1针,口蹄疫疫苗另作1针同时分点注射;免疫效果最差的是高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪口蹄疫3种疫苗同时分3点注射。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

从天津和内蒙古猪场中分离到2株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（TJ和NM1）,将TJ株经Marc-145细胞连续传代92代,得到致弱疫苗株TJM株。采用RT-PCR方法扩增TJ、NM1和TJM完整的ORF5基因片段,进行序列测定,并与其他国内外毒株的ORF5基因序列进行了比较和变异分析。结果表明：TJ株和NM1株ORF5基因与国内分离的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）具有较高的同源性,均为99.5%~99.8%,与欧洲型PRRSV同源性最低,分别为63.3%和63.5%。致弱疫苗株TJM与其原始毒株TJ相比有4个氨基酸发生突变（F23S,G80V,R151K,Q196R）,这些突变可能与TJ株毒力的降低有关。

应用生物反应器生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原

应用激流式生物反应器培养Marc-145细胞生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒,并通过工艺优化,实现了病毒抗原的高效生产。首先将Marc-145细胞用含6 0mL/L牛血清的DMEM培养液复苏放大培养,当细胞量达到3×109时,接种入反应器中。先用细胞生长液培养,当细胞达到最大量时更换生长液为维持液,并接种HP-PRRSV。整个过程采用流加方式,每8h采样测定培养上清中葡萄糖浓度。接种病毒后,每24h测定培养上清HP-PRRSV滴度。6个批次细胞生长至88h,糖耗达到最高水平。连续3个批次种毒后培养至96h,上清中HP-PRRSV滴度达到最高,平均约为每106.4 TCID50/0.1mL。因此,认为应用激流式生物反应器进行细胞培养,通过过程工艺优化,可以实现HP-PRRSV抗原的高滴度生产。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)基因组序列设计1对特异性引物,建立一种基于SYBR Green I实时PCR检测HP-PRRSV的方法。结果表明,该方法能够检测到HP-RRSV的存在,不与其它猪源病毒发生非特异性反应,标准曲线线性范围为1011拷贝/反应～102拷贝/反应。与常规PCR方法相比,两者的符合率100%。该方法具有快速、简便、敏感等优点,具有重要的实用价值。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断高致病性猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病,根据GenBank中登录的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Nsp2基因缺失区和猪伪狂犬病病毒(PRV)gB基因保守区序列,分别设计并合成了2对特异性扩增引物,通过对反应条件的优化,建立了能够同时检测HP-PRRSV和PRV的双重PCR诊断方法。利用建立的双重PCR方法对30份临床可疑样品进行检测,并与商品化单项PCR试剂盒进行对比验证。结果表明,本试验建立的双重PCR方法具有较高的灵敏度和特异性,与商品化单项PCR试剂盒检测结果完全一致。因此,该双重PCR方法能够用于HP-PRRSV和PRV单项或混合感染的临床样品快速鉴别检测。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征协同感染及防制研究进展

高致病性猪繁殖与呼吸综合征是影响养猪业的重大疫病,自2006年发生以来,已蔓延全国,给养猪业带来巨大经济损失。尽管采取了许多防控措施,但效果不甚理想,协同感染的存在要求必须采取综合控制措施。作者就高致病性猪繁殖与呼吸综合征的协同感染、疫苗预防、中药防制、生物安全及解除免疫抑制等研究进展作一综述。

两株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪霍乱沙门氏菌的分离及人工共感染猪的致病性试验

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与细菌混合感染的情况,本研究采用RT-PCR方法对不同猪场采集的样品进行PRRSV检测,并进一步对PRRSV阳性样品进行细菌培养分离,经BIOLOG细菌鉴定仪鉴定,分离培养的细菌为猪霍乱沙门氏菌(S.cholersuis)。利用分离获得的2株PRRSV和一株S.cholersuis进行动物回归试验,结果表明所有人工感染猪在感染后的第5 d出现病毒血症;2份PRRSV分离株单独人工感染的发病率均为100%,死亡率分别为55.6%和100%;PRRSV与S.cholersuis共感染的动物死亡率均为100%。与单独的PRRSV感染组相比,PRRSV与S.cholersuis共感染后实验动物的发病和死亡时间大大缩短,进一步表明其混合感染具有协同致病性,导致发病率和死亡率的上升。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)临床免疫效果的研究

为评价高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)的临床免疫效果,分别选择PRRS阴性猪场、PRRS免疫阳性猪场和PRRS野毒感染猪场进行免疫接种研究,接种剂量分别为1头份和2头份,接种后观察猪群临床症状,监测抗体水平并抽取部分仔猪进行攻毒试验。结果表明:PRRS阴性猪场和PRRS免疫阳性猪场接种TJM-F92株疫苗后,仔猪保育阶段成活率、育肥阶段成活率、出栏率及母猪窝产健活仔数与未免疫猪比较无明显差异,仔猪免疫后第28天攻毒保护率均为80%。PRRS野毒感染猪场接种疫苗后仔猪保育阶段成活率、育肥阶段成活率、出栏率及母猪窝产健活仔数均明显提高。说明高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)具有较好的临床保护效果。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株及其致弱过程中的不同代次病毒的分子特征分析

为了追踪高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,HP-PRRSV)毒力逐渐减弱的分子轨迹,我们以HP-PRRSV亲本毒HuN4株及其系列传代致弱毒株为研究对象,对HuN4株及其不同代次毒株其全基因序列进行了序列比较分析。结果显示由高致病性的亲本毒HuN4株到无致病性的F112代的疫苗毒,共有65个核苷酸发生突变,其中导致41个氨基酸发生突变,这些突变的氨基酸分散性的存在于不同基因区域。与已经报道的高致病性JXA1株及其致弱毒株JXA80株相比较,可以看到两个强毒株毒力致弱的演变轨迹并不完全相同,二者之间不仅氨基酸突变数量不一致,而且突变氨基酸的位置也不完全相同,但其共同特点是由强毒株到弱毒株的变化过程中,突变率较高的结构蛋白相一致,突变率较高的非结构蛋白基本一致。分析结果提示我们决定高HP-PRRSV毒力强弱的因素可能不是由单个氨基酸的突变来决定的,推测是由一个基因或多个基因或多种因素共同造成的,同时也使我们认识到PRRSV的非结构蛋白区在病毒毒力变化中可能发挥重要作用。