非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的以及本实验室分离鉴定的PRRSV的nsp2基因序列,在nsp2缺失区的两端的保守区设计并合成了一对引物,建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法。该方法扩增高致病性PRRSV基因组时可获得230bp的片段,扩增经典型PRRSV时则获得320bp的片段,根据RT-PCR产物大小可将二者区分开来。通过大量临床病料的检测,并配合PCR产物测序验证,结果表明该方法简便、快速、特异,可以鉴别高致病性PRRSV,为进一步的PRRS流行病学研究提供了重要的技术手段。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

2006年6月份以来,我国多个省份暴发高致病性猪繁殖与呼吸综合征,给我国养猪业造成了巨大经济损失。为全面了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在我国的流行情况以及遗传变异规律,本研究采用RT-PCR的方法,对从2006年8月至2007年10月期间,来自于19省(市)共474份样品进行高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸的检测,结果检出阳性样品294份。在各省不同时期样品中均有阳性样品检出。通过对阳性样品进行Nsp2基因和ORF5基因扩增,序列分析发现所有检测的猪繁殖与呼吸综合征病毒株高度同源,为同一毒株遗传变异而来,所有猪繁殖与呼吸综合征毒株与HB-1株遗传关系最近;且Nsp2均缺失30个氨基酸。

猪α干扰素的原核表达及抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

为了研究高效广谱的基因工程抗病毒制剂,本研究采用PCR技术自猪肝脏总DNA中扩增、克隆猪α干扰素(PoIFN-α)成熟肽基因并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪α干扰素(rPoIFN-α)蛋白通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用细胞病变抑制法分别测定rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗水泡性口炎病毒(VSV)增殖活性及在Marc-145细胞上抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的增殖活性,以分别评价rPoIFN-α的活性单位及其体外抑制高致病性PRRSV增殖所需的最低浓度。结果表明,克隆的PoIFN-α成熟肽基因全长501bp,编码166个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子量大小20.7ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白纯度在95%以上;纯化的rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗VSV病毒活性单位为1.4482×104IU/mL(5.2×106IU/mg),在Marc-145细胞上能完全抑制高致病性PRRSV增殖所需的rPoIFN-α蛋白最低有效剂量为640U/mL(2.3×104U/mg)。这些研究结果为新型基因工程抗病毒制剂的开发以及用于高致病性PRRSV性疾病的预防和治疗奠定了基础。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及其体外传代遗传变异分析

从临床"高热综合征"病例分离到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株,经细胞传代和蚀斑克隆,培育成功增殖性能稳定的新毒株,命名为PRRSV-HBR。该毒株接种细胞后能够产生细胞病变(CPE),随传代次数增加毒价显著提升,第45～60代毒价测定达107.5TCID50/mL。采用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测病毒抗原分布在细胞浆中;电镜观察到的病毒粒子呈圆形,直径约50nm～55nm。分离株Nsp2基因序列中第483位和535～563位氨基酸存在缺失,属PRRSV变异株。该毒株Nsp2基因序列比较发现,经细胞传40代后第3115位核苷酸处插入12个碱基序列(GAGATCGCCTTT)。用该毒株第5代培养物滴鼻接种试验猪(1.0×104.5TCID50),临床表现为持续高热(≥40.5℃,9d～12d)、食欲下降、精神萎靡、消瘦、眼睑水肿、体表淋巴结肿大等,发病率为100%(10/10),死亡率为30%(3/10)。研究表明,PRRSV-HBR分离株对靶动物具有高致病力,培育的细胞适应毒株体外繁殖能力稳定,并产生了标志性基因突变,为该病毒致病机理、遗传变异规律、疫苗免疫等研究奠定了基础。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病和副猪嗜血杆菌病混合感染的诊断与防制

目前在集约化养殖场的猪群中经常出现病毒病和细菌病的混合感染,严重影响中国养猪业的发展。2011年9月,广东某个千头母猪场的猪群大量发病,表现为高热、咳嗽、食欲下降、皮肤发绀、关节肿大等临床症状。通过流行病学调查、剖检、细菌分离鉴定、药敏试验、PCR和RT-PCR等实验室检测最终确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病和副猪嗜血杆菌病的混合感染,在此基础上提出和实施了该病的防控方案。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株主要囊膜糖蛋白GP5的遗传变异分析

为了探究高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)的遗传变异特征,本研究对GenBank中235株HP-PRRSV GP5序列的遗传进化、主要氨基酸基序、抗原性以及N-糖基化位点数量和位置的变异进行了分析。结果表明HP-PRRSV之间的同源性较高,与其他参考毒株相比,这些病毒处于一个相对独立的分支中,而且与经典疫苗株的亲缘关系较远。这有助于解释经典疫苗株对于HP-PRRSV为何起不到理想的免疫保护效果。在病毒的中和表位序列中存在着规律的点突变,同时抗原性比较显示HP-PRRSV与经典毒株之间存在着一定的差异。绝大多数的HP-PRRSV的N-糖基化位点在数量上多一个,而且位置要向羧基端平移2个氨基酸,从而使得中和表位两侧直接与糖链相连,可能会造成中和表位被糖侧链所遮掩,本研究由此推测减弱中和抗体对HP-PRRSV的有效识别,促进病毒逃避机体体液免疫。

中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究

【目的】对来自2006年猪病流行爆发地的组织样品进行多种病毒的检测,确定引起本次流行的致病病原及PRRSV的分子流行病学特征。【方法】利用(RT-)PCR对采集的样品进行PRRSV北美型和欧洲型、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)以及瘟病毒的检测,对PRRSV阳性的进行ORF5的序列测定并分析。【结果】检测到16份PRRSV北美型阳性样品,PCV2阳性样品2份,其它病毒均未检到。PRRSV ORF5序列分析表明笔者分离到的PRRSV株可分为2个群。【结论】(1)PRRSV与2006年肆虐中国养猪业的猪病流行有直接关系;(2)2006年PRRSV流行株主要是以JX0612株为代表,但不同遗传特征的PRRSV也在流行。

高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP/LP-PRRSV)快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的HP-PRRSV与LP-PRRSV的Nsp2基因序列,分别设计了特异性的上游引物(HP-Upper-p1/LP-Upper-p2)和共用下游引物(Co-Lower-p3)。以HP-PRRSV和LP-PRRSV混合物总RNA为反转录模板,建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV的二重RT-PCR检测方法;并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果显示,本试验成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,该方法灵敏度高,最低检出限均为100拷贝/μL;重复性好,特异性强,可特异性地扩增HP-PRRSV细胞培养物和LP-PRRSV疫苗毒,但对Marc-145细胞和其他8种病原对照扩增不出任何条带;自25份临床疑似PRRSV感染病料中共检测出了21份PRRSV阳性样品,其中HP-PRRSV阳性样品共计20份,LP-PRRSV阳性样品4份。结果表明,本研究成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,可适用于高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断。

猪圆环病毒2型感染对高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫应答的影响

采用阻断ELISA法对单独接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征组(hpPRRS,B组)及PCV2人工感染21d后接种hpPRRS疫苗组(PB组)不同时期血清中的PRRSV抗体进行检测,同时对不同时期前腔静脉血进行CD4/CD8流式细胞术及血常规分析。结果表明,在接种后32dB组白细胞含量极显著高于PB组(P<0.01),接种后62dB组淋巴细胞含量极显著高于PB组(P<0.01),接种后75dPB组幼稚型Th细胞含量显著高于B组(P<0.05),接种后32、62及75dB组Tc细胞含量为PB组的2.40、1.98和1.86倍,接种后32、48及62dB组记忆/激活Th细胞含量分别为PB组的1.54、1.46及1.32倍。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

从天津和内蒙古猪场中分离到2株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（TJ和NM1）,将TJ株经Marc-145细胞连续传代92代,得到致弱疫苗株TJM株。采用RT-PCR方法扩增TJ、NM1和TJM完整的ORF5基因片段,进行序列测定,并与其他国内外毒株的ORF5基因序列进行了比较和变异分析。结果表明：TJ株和NM1株ORF5基因与国内分离的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）具有较高的同源性,均为99.5%~99.8%,与欧洲型PRRSV同源性最低,分别为63.3%和63.5%。致弱疫苗株TJM与其原始毒株TJ相比有4个氨基酸发生突变（F23S,G80V,R151K,Q196R）,这些突变可能与TJ株毒力的降低有关。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)基因组序列设计1对特异性引物,建立一种基于SYBR Green I实时PCR检测HP-PRRSV的方法。结果表明,该方法能够检测到HP-RRSV的存在,不与其它猪源病毒发生非特异性反应,标准曲线线性范围为1011拷贝/反应～102拷贝/反应。与常规PCR方法相比,两者的符合率100%。该方法具有快速、简便、敏感等优点,具有重要的实用价值。

乳猪“高热症”猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与致病性分析

本研究针对疑似高热症疫情的猪场,从分离病原的致病特性及基因特征,对高热症的病因进行了探索。以RT-PCR/PCR从临床病料中检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)核酸,利用Marc-145细胞从病料中分离到PRRSV(XS070425毒株)。测序结果显示,XS070425毒株Nsp2基因无高致病性PRRSV Nsp2基因533～561位连续29个氨基酸"RPVTPLSEPIPVPAPRRKFQQVKRLSSAA"的缺失;但遗传进化分析显示,XS070425毒株Nsp2、ORF5基因与近期我国报道的高致病性PRRSV-HuN4和JXA1有较高的同源性,达95%～96%。致病性试验显示,PRRSV-XS070425原始病料悬液和Marc-145细胞分离物接种健康猪后,病毒血症可持续26d,并出现典型的PRRS临床症状和体温升高,但不致死感染猪。这些结果说明,无NSP2蛋白29个氨基酸残基缺失的PRRSV也是猪高热症的重要病原。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断高致病性猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病,根据GenBank中登录的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Nsp2基因缺失区和猪伪狂犬病病毒(PRV)gB基因保守区序列,分别设计并合成了2对特异性扩增引物,通过对反应条件的优化,建立了能够同时检测HP-PRRSV和PRV的双重PCR诊断方法。利用建立的双重PCR方法对30份临床可疑样品进行检测,并与商品化单项PCR试剂盒进行对比验证。结果表明,本试验建立的双重PCR方法具有较高的灵敏度和特异性,与商品化单项PCR试剂盒检测结果完全一致。因此,该双重PCR方法能够用于HP-PRRSV和PRV单项或混合感染的临床样品快速鉴别检测。

应用生物反应器生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原

应用激流式生物反应器培养Marc-145细胞生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒,并通过工艺优化,实现了病毒抗原的高效生产。首先将Marc-145细胞用含6 0mL/L牛血清的DMEM培养液复苏放大培养,当细胞量达到3×109时,接种入反应器中。先用细胞生长液培养,当细胞达到最大量时更换生长液为维持液,并接种HP-PRRSV。整个过程采用流加方式,每8h采样测定培养上清中葡萄糖浓度。接种病毒后,每24h测定培养上清HP-PRRSV滴度。6个批次细胞生长至88h,糖耗达到最高水平。连续3个批次种毒后培养至96h,上清中HP-PRRSV滴度达到最高,平均约为每106.4 TCID50/0.1mL。因此,认为应用激流式生物反应器进行细胞培养,通过过程工艺优化,可以实现HP-PRRSV抗原的高滴度生产。

高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒感染猪主要脏器的超微结构变化

对高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(HP-PRRSV)人工感染的成年猪脏器进行透射电子显微镜观察,结果发现,肺部组织细胞病变最严重,部分毛细血管破裂,毛细血管内皮细胞裂解,肺泡巨噬细胞线粒体嵴肿胀严重;脑部组织神经元细胞凋亡和胶质细胞坏死;肾脏和淋巴结组织中均出现病毒的复制和线粒体嵴的肿胀。该结果为阐明HP-PRRSV的致病机理提供了实验依据。

1株临床高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

本研究从江苏省某猪场患有明显呼吸道临床症状和高热死亡的仔猪肺脏组织中分离到一株病毒,经病毒生物学特性测定、血清学试验、病毒基因鉴定,确定为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。人工猪体感染发病试验表明,该分离株可以引起商品仔猪出现明显临床症状和死亡,证实我国已经出现临床高致病性PRRSV毒株。

云南高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因变异分析

采用RT-PCR技术对云南2007年采集的48份猪组织样品中病毒Nsp2基因进行检测,获得阳性样品14份,选择5份代表性样品将其PCR产物纯化后,克隆至pMD18-T载体测序,并与已知代表性毒株进行比较及系统发育分析。结果发现云南病毒样品Nsp2基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为95.8%～99.0%和92.3%～98.6%。5份样品病毒Nsp2蛋白482位、534位～562位氨基酸均存在缺失,其中1份样品(YNMG)486位～489位氨基酸也发生了缺失。云南病毒样品在系统发育树上可划分为4个亚组群,分别与广东、广西、贵州、浙江、江苏、山东毒株遗传关系密切。

两株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪霍乱沙门氏菌的分离及人工共感染猪的致病性试验

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与细菌混合感染的情况,本研究采用RT-PCR方法对不同猪场采集的样品进行PRRSV检测,并进一步对PRRSV阳性样品进行细菌培养分离,经BIOLOG细菌鉴定仪鉴定,分离培养的细菌为猪霍乱沙门氏菌(S.cholersuis)。利用分离获得的2株PRRSV和一株S.cholersuis进行动物回归试验,结果表明所有人工感染猪在感染后的第5 d出现病毒血症;2份PRRSV分离株单独人工感染的发病率均为100%,死亡率分别为55.6%和100%;PRRSV与S.cholersuis共感染的动物死亡率均为100%。与单独的PRRSV感染组相比,PRRSV与S.cholersuis共感染后实验动物的发病和死亡时间大大缩短,进一步表明其混合感染具有协同致病性,导致发病率和死亡率的上升。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒BJSD株和BJPG株序列分析

本研究旨在预测与分析高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒BJSD株和BJPG株序列特点,为其下一步研究作准备。利用分子生物学软件及服务器,对BJSD株和BJPG株全序列及各结构蛋白的生化特性、溶解性和核定位信号等进行了分析,结果显示BJSD株和BJPG株至少有12个非结构蛋白和6个结构蛋白;同源性比较结果显示GP3和GP5蛋白变异性高,M和N蛋白保守。GP3、GP5和M蛋白糖基化位点与参考株相比有变化,GP2、GP4和N蛋白糖基化位点与所有参考株一致。服务器预测BJSD株和BJPG株GP2、M和N蛋白生化特性显示各项数据完全一致,其中N蛋白的碱性氨基酸比例明显高于其他蛋白,总平均亲水值明显低于其他蛋白;GP2、GP3和GP4蛋白不稳定,GP5、M和N蛋白稳定。BJSD株和BJPG株可溶性只有GP3和GP5略有差别,其余蛋白数据一致,6个结构蛋白预测不溶性概率均在66%以上,GP3不溶性概率最高。BJSD株和BJPG株结构蛋白核定位结果显示,两株仅GP3和GP5有差异,其余蛋白分布情况完全一致。可以利用以上一些不同于以往各代表株的特点,对PRRS的诊断和防制做进一步的研究。