2024年美国奶牛H5N1亚型高致病性禽流感疫情分析

2024年3月以来,美国报告了多例奶牛H5N1亚型高致病性禽流感病例,引发全球广泛关注。本文对本次疫情进行了系统梳理,分析了疫情流行情况和分布规律,提出了风险防范建议。现有数据表明,引发奶牛感染的H5N1亚型高致病性禽流感病毒属于2.3.4.4b分支,与美国同期在家禽和野禽中流行的毒株高度同源。初步分析表明,感染奶牛的病毒可能来源于野生候鸟。疫情发生后,美国采取了限制移动、调运检测等综合防控措施。本次疫情可能对美国奶牛产业造成一定程度的负面影响,但从目前来看对我国影响较小。建议持续进行国外疫情监视,国内加强野禽风险监测,强化家禽强制免疫,积极宣传引导,做好应急储备等,降低本次疫情对我国的影响。

一株野鸟源H5N8高致病性禽流感病毒的遗传演化分析及生物学特性研究

2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8),简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其基因组测序并经遗传演化分析,结果显示,该病毒HA蛋白的裂解位点为PLREKRRKR↓GLF,符合高致病性AIV(HPAIV)的分子特征。在遗传进化上HA基因属于2.3.4.4b分支,外部基因与部分内部基因(PB1、PA、NP、NS)均与2020年~2021年分离到的H5N8亚型AIV相应基因的同源性最高,且处于同一分支;PB2基因与一株H9N2亚型AIV PB2基因同源性最高,为99.25%;M基因与近两年流行的2.3.4.4b分支H5N1亚型AIV同源性最高,且处于同一分支,推测该病毒为一株重组病毒。抗原性分析结果显示,该病毒与2.3.4.4分支H5-Re8、2.3.4.4b分支H5-Re14疫苗株抗原性相近。不同哺乳动物细胞系生长曲线结果显示,该病毒可在哺乳动物细胞系中有效复制,但其在A549中的复制效率高于其在MDCK及293T细胞中的复制效率。BALB/c小鼠感染实验结果显示,该病毒不经提前适应即可在小鼠的多脏器中有效复制,对小鼠的半数致死量(MLD50)为0.98log10EID50,对小鼠呈高致病性。本研究结果对H5亚型HPAI的综合防控和公共安全预警具有借鉴意义。

鸽H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及致病性试验

H9N2亚型禽流感病毒属于A型流感病毒,目前H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染家禽,而且可以感染猪、猫等哺乳动物,甚至出现人类感染现象。因此,H9N2亚型流感病毒不仅影响畜禽的健康养殖,同时也具有一定的公共卫生学意义。近年来鸽群感染流感病毒时有报道,这其中包括H5N1、H7N9以及H9N2亚型禽流感病毒。虽然H9N2亚型禽流感毒株的致病性相对于H5和H7亚型较低,但是该亚型病毒在我国家禽中存在较为普遍,且目前从鸽子已分离到重组的H9N2毒株,该毒株不仅引起鸽子感染而且具有优先与人类呼吸道表面受体结合的能力,因此加强流感病毒在鸽群中流行情况具有重要的现实意义。

HA和NA匹配度对H5亚型高致病性禽流感假病毒影响的研究

为研究不同H5亚型高致病性禽流感病毒(H5 HPAIV)的HA和NA匹配度对流感假病毒组装和功能的影响,本研究将5株H5 HPAIV的HA和NA基因节段分别克隆于pCMV/R载体,构建3个HA和5个NA重组质粒,两两随机组合后将HA、NA质粒与pCMV/RΔ8.9质粒、p HR-CMV-Luc质粒构成4质粒系统,利用磷酸钙法将4个质粒转染HEK293T细胞,检测各细胞培养上清液血凝效价,结果显示:有3个上清液无血凝效价,其余12个上清液的血凝效价在100 HAU/m L~400 HAU/m L,表明获得12株具有血凝效价的流感假病毒。超速离心后获得浓缩假病毒,通过western blot检测假病毒HA蛋白的表达,结果显示各假病毒均在75 ku、50 ku和25 ku有特异性条带。利用各假病毒分别感染MDCK.1细胞60 h后裂解细胞,采用荧光素酶试验检测假病毒的相对荧光素酶活性(RLA),结果显示各假病毒RLA在5.0×10~1~4.5×10~5不等。上述结果首次表明不同H5 HPAIV的HA和NA相互匹配会对假病毒的血凝效价和相对荧光酶活性(RLA)造成影响。本研究为后续流感病毒灭活疫苗制备及抗病毒药物的研发奠定基础。

全球首例人感染高致病性H5N8禽流感病毒基因特征和进化分析

目的分析全球首例人感染高致病性H5N8禽流感病毒基因进化及变异位点,为高致病性H5N8禽流感病毒的风险评估提供科学依据。方法在GISAID数据库下载H5N8禽流感病毒全基因组序列,利用MEGA软件最大似然法构建基因进化树,分析基因组的关键性变异位点。结果通过基因进化分析,全球首例人感染H5N8禽流感病毒属于H52.3.4.4 b分支;该病毒基因组和A/chicken/Astrakhan/2171-1/2020、A/chicken/Astrakhan/321-10/2020和A/chicken/Astrakhan/321-06/2020等病毒基因组相似度最高(99%~100%);HA基因的受体结合位点222-224位氨基酸为QRG(H5编码),病毒更加倾向结合禽α-2,3唾液酸受体;在PB2基因上未出现E627K、D701N等哺乳动物适应性氨基酸突变位点;NA和M2基因上没有出现对神经氨酸酶抑制剂和金刚烷胺类药物的耐药性突变,对抗病毒药物仍具有敏感性。结论目前的高致病性H5N8禽流感病毒尚未适应人,不具备人传人的能力,但仍要密切监测H5N8禽流感病毒的基因组变异。

H5N2亚型禽流感病毒分离鉴定与鸡致病性研究

禽流感是由A型禽流感病毒引起的,多种家禽及野生禽类发病的一种高度接触性传染病,又称为“真性鸡瘟”或“亚洲鸡瘟”,其表现形式是多种多样的,有的只能通过检出抗体和分离病毒才能确诊感染疾病。在本研究中,从患有禽流感病史的鸡中,分离出了一株H5N2亚型禽流感病毒,导致鸡胚半数感染量以及致死量居高不下,因此研究H5N2亚型禽流感病毒的分离和鉴定,以及其对鸡的致病性,这对于我国禽类养殖中能有效防控禽流感具有重大的意义。

一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

分离到一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒,SPF鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感.病毒感染小鼠后不致病,但能够在肺内有效复制,表明其具有感染哺乳动物的潜在风险.血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点上插入有多个连续的碱性氨基酸(-RRRKKR-),从分子上证实这是一株高致病性禽流感病毒.核酸序列比较分析表明,分离的流感病毒HA基因与A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)同源率达到99.4%,神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率达到99.8%;氨基酸水平上,HA与2004年分离到的A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)、A/swan/Guangxi/307/2004(H5N1)、A/wildduck/Guangdong/314/2004(H5N1)和A/chicken/Henan/210/2004(H5N1)同源率均为99.3%,NA与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率为99.6%.进化树分析结果表明,该流感病毒分离株可能是由H5N1和H9N2两个亚型病毒重排而来.

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系统的建立

A/goose/Guangdong/1/96(GSGD/1/96)是中国分离的第1株H5N1亚型禽流感病毒,它不仅是97香港感染并致人死亡的H5N1亚型流感病毒HA基因供体株,而且是中国目前已报到的H5亚型流感病毒分离株的共同祖先。本研究建立了该病毒的8质粒反向基因操作系统,并通过细胞转染成功拯救了该病毒(R-GSGD/1/96)。R-GSGD/1/96在对SPF鸡和Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒(W-GSGD/1/96)一致的生物学特性,即对鸡都是高致病性毒株,R-GSGD/1/96与W-GSGD/1/96的静脉致病指数分别为2.01和2.10;救获病毒与野生病毒一样,尽管106EID50经鼻腔感染小鼠后1～2d内能从肺脏检测到低滴度的病毒,但不能在小鼠体内成功复制。GSGD/1/96反向基因操作系统的成功建立为进一步开展中国高致病性禽流感病毒分离株的生物学特性、遗传衍化及结构与其功能关系研究奠定了基础。

高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎的影像学表现特点

目的探讨高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎的影像学检查方法及胸部X线与CT影像表现特点。方法回顾性分析2006年6月深圳接诊的首例由卫生部确诊,并经过抢救治疗痊愈的高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎患者的相关临床及影像学资料。结果胸部影像学特点是:①磨玻璃样影、大小片状影及肺实变影是人禽流感病毒性肺炎较早出现的影像表现;②病灶侵犯肺组织广泛,表现为多叶多段的两肺广泛受累;③病灶蔓延变化迅速;④肺实质、肺间质及胸膜受累可同时存在;⑤病灶吸收慢、迁延时间长,恢复期有肺纤维化的影像表现。结论影像学检查与诊断仍然是人禽流感病毒性肺炎的临床诊断、鉴别诊断、疗效评价及预后分析的重要手段。动态观察人禽流感病毒性肺炎的影像学变化及影像学表现特点,监测ARDS和肺部继发感染等并发症的发生,利于指导临床及时有效地进行治疗。

一例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)的流行病学调查

目的通过对1例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)的调查分析,为制定人禽流感预防控制措施提供科学依据。方法采用流行病学调查、临床检查、血清学检查和 RT-PCR、 Real-time PCR 法进行分析和诊断。结果发现1例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1),经救治无效因呼吸衰竭死亡。患者有明确的病、死禽接触史。采用隔离治疗、个人防护、医学观察、消毒等措施,疫情得到控制,未出现二代病例。结论需加强禽流感疫情监测,采取综合防控措施,预防疫情再次发生。

HA 226/228双位点突变对H5N1禽流感病毒受体结合特异性和致病性的影响

禽流感病毒(AIV)主要识别SAα2,3Gal受体,而人源流感病毒主要识别SAα2,6Gal受体。本研究利用糖链受体结合特性检测方法检测表明,H5N1 AIV A/duck/Guangxi/35/2001(DK/35)可以同时识别SAα2,3Gal和SAα2,6Gal受体,然而HA 226位谷氨酸(Q)到亮氨酸(L)和228位甘氨酸(G)到丝氨酸(S)的双突变,可以导致DK/35更倾向于识别SAα2,6Gal受体。对BALB/c小鼠致病性试验显示,突变病毒株(rDK/35(Q226L/G228S))对小鼠的致病力比野毒株弱,其MLD50为4.7 log10EID50,而DK/35为1.8 log log10EID50。本研究表明H5N1 AIV通过突变可以获得优先与SAα2,6Gal受体特异性结合的能力,为H5N1 AIV的监测预防和对公共卫生风险评估提供一定的参考依据。

高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白NP真核表达载体的构建、表达与鉴定

目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。

人感染高致病性禽流感病毒A/Fujian/1/2007(H5N1)株基因组序列测定及分析

目的对福建省分离的高致病性禽流感病毒A/Fujian/1/2007(H5N1)株进行全基因组序列测定,了解病毒序列及进化特征。方法SPF鸡胚分离法分离A/Fujian/1/2007(H5N1)株病毒,并提取病毒RNA。病毒RNA经通用引物逆转录后,应用特异性引物分别扩增病毒各节段,产物经TA克隆到载体中进行测序并对结果进行排列、拼接成完整的病毒基因组。分析病毒重要位点特征,并参照已发表的病毒序列,对A/Fujian/1/2007(H5N1)株作系统进化分析。结果应用自行设计的引物,扩增并获得完整的A/Fujian/1/2007(H5N1)株基因组序列。病毒重要位点的分析表明,该株病毒为禽源高致病性禽流感病毒,病毒对达菲敏感而对金刚烷胺类药物则具有耐药性。病毒特征有待进一步的生物学验证。系统进化分析显示,在亚洲各国引起人类感染的高致病性禽流感病毒具有明显的地理分布特征,A/Fujian/1/2007(H5N1)病毒与国内以往毒株属同一进化分支。结论获得人感染高致病性禽流感病毒A/Fujian/1/2007株全基因组序列,了解病毒重要的氨基酸位点特征以及亚洲人感染病毒间的亲缘关系,为进一步探讨福建省禽流感病毒变异、传播机制等奠定基础。

应对高致病性禽流感病毒H5N1抗原漂移的通用疫苗策略

高致病性禽流感病毒(HPAIV)H5N1不仅能造成严重的病理损伤,而且能够跨越种间隔离从禽类直接传播给人类,对人类健康造成巨大的威胁。疫苗免疫是应对HPAIV H5N1最常用的防控手段。但由于流感病毒具有抗原漂移和抗原转变的能力,只针对特定流行株的常规疫苗不能够有效的应对毒株的不断变异。研制能够激发广泛保护作用的通用疫苗是应对HPAIV H5N1抗原漂移的一种有力措施,该类疫苗以流感病毒中高度保守的蛋白结构域,如M2蛋白胞外域(M2e)、HA蛋白的茎部结构域以及其他的保守抗原表位为免疫原,激发机体产生广泛的保护以应对不断变异的流感病毒。论文主要对现阶段通用疫苗的研究思路及进展做一梳理,以期能够为禽流感疫苗的研制提供有益的帮助。

H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达及免疫原性

用昆虫杆状病毒表达系统表达了高致病性禽流感H5N1 HA蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,HA蛋白表达分子量约为70 ku;将HA蛋白制成油乳液,免疫BALB/c小鼠,免疫3次后,收集血清,以血凝抑制试验(HI)和血清IgG抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)评估体液免疫,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)评估细胞免疫。试验结果表明:重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组免疫小鼠后,血清中和抗体效价及ELISA IgG效价均显著高于PBS组,重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。ELISPOT试验数据显示,重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组小鼠脾单个核细胞分泌IFN-γ和IL-4细胞数量显著高于PBS组,而重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。用昆虫杆状病毒表达系统表达H5N1 HA蛋白制成油乳液能诱导体液免疫和细胞免疫,能为预防高致病性禽流感H5N1候选疫苗的筛选提供依据。

陕西省一起野禽H5N8亚型高致病性禽流感疫情紧急流行病学调查

2021年6月9日,陕西省神木市红碱淖国家级自然保护区发生一起野禽H5N8亚型高致病性禽流感疫情。为了解该起疫情的发生经过、可能来源、内部传播方式以及对外扩散风险,组织开展了流行病学调查。现场调查发现:5月27日该保护区的黑颈䴙䴘种群开始发病死亡,28日保护区工作人员发现后上报疫情,经国家禽流感参考实验室确诊为H5N8亚型高致病性禽流感疫情;截至6月26日,累计死亡黑颈䴙䴘5486只,未见其他鸟类及周边家禽异常死亡。采样检测发现,野禽环境中病毒污染面较小,家禽中未检出病原,家禽H5亚型禽流感免疫抗体水平较高。调查认为:疫情由迁徙候鸟感染禽流感病毒传入引起,发病局限于野禽;因红碱淖水质碱性较强,病毒存活时间较短,疫情经湖水传播的风险性较小。疫情确诊前,保护区已采取了无害化处理病死禽、消毒、人车管控等措施,当地农业农村部门对周边家禽开展了禽流感紧急疫情排查和强化免疫。因此,结合现场调查和实验室检测结果,推断疫情由野禽向家禽扩散风险很低。本次疫情提示,应多部门密切协作,持续做好高致病性禽流感疫情监测工作,做到疫情早发现,果断处置,以降低疫情扩散风险。

贵州省第2例高致病性禽流感A/H5N1病毒感染患者体外膜肺氧合的护理

高致病性禽流感A／H5N1病毒感染（简称人禽流感）一其临床特点表现为流行病学不典型、散在发病、发现晚、病情重、进展快、病死率高的特点，全球已确诊病例共582例，其中343例死亡；截至2012年1月5日，中国内地已确诊41例，其中27例死亡。

两株H5N1高致病性禽流感病毒对小鼠的致病力研究

为比较2株H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)对哺乳动物的致病力,本研究选取了A/Anhui/2/05(AH/2/05)和A/Sichuan/81/05(SC/81/05)两株病毒,采用低剂量(10 EID50)感染小鼠模型,并就两株病毒对小鼠的致病力差异进行检测。结果表明AH/2/05感染后小鼠出现体重下降和神经症状,并可致死部分小鼠;SC/81/05感染小鼠后,小鼠无任何明显的症状,体重、食欲、精神状态均不受影响。AH/2/05感染后病毒可在小鼠的全身复制,病毒在小鼠体内的存活时间可以长达14 d。SC/81/05感染后病毒仅在小鼠的肺脏中复制,并且仅能够在感染后的3 d和5 d分离到病毒。病理学检测显示,AH/2/05感染后病毒存在于小鼠的各脏器细胞并且引起小鼠脏器组织的严重病理变化,而SC/81/05感染后并未对小鼠组织脏器造成明显的病理变化。本研究结果揭示了人源和禽源H5N1禽流感病毒低剂量感染对小鼠的致病差异,同时为进一步研究H5N1亚型HPAIV在哺乳动物中的感染和致病能力提供了相关的实验依据。

多重荧光定量RT-PCR检测高致病性H5N6禽流感病毒

目的建立一种快速检测流感病毒A型(FluA)及高致病性禽流感(HPAI)H5N6病毒感染的荧光定量RT-PCR法。方法以人细胞核糖核酸酶P(RP)基因作为临床样本的内参基因,用Primer Express 3.0软件设计PCR特异性引物和探针,建立一种检测FluA及HPAI-H5N6病毒的一步法多重荧光定量RT-PCR方法,评估其灵敏度、特异性,并与上海之江公司提供的试剂及测序法进行比较。结果建立的多重荧光定量RT-PCR法检测FluA、H5、N6及RP质粒标准品的灵敏度均达102copies/m L。各对引物和相应探针仅检测出相应的病毒,在这些病毒和常见病原分析中未发现存在交叉反应,特异性达100%。用该法检测135例临床标本,结果显示FluA为23例,未发现HPAI-H5N6病毒的感染者;与上海之江公司提供的试剂的检测结果及基因测序结果一致。结论建立的一步法多重荧光定量RT-PCR法可用于FluA及HPAI-H5N6病毒感染患者的早期诊断。