高致病性PRRSV Nsp2变异株Power SYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立

根据高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了1对引物,建立了Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测高致病性PRRSV Nsp2变异株。以pMD-Nsp2质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。结果显示,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号;检测线性范围广,在模板浓度为3.15×10^9-3.15×10^0copies/μL具有良好的线性关系,相关系数（r^2）为0.998;最低检测限为3.15copies/μL。对25份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%。表明,建立的Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。

人工感染高致病性PRRSV肺脏的病理学观察和扫描电镜的形态学变化

通过人工感染高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)观察猪肺脏的组织病理学变化以及扫描电镜下的形态学变化。将14头健康猪分成试验组和对照组,用高致病性PRRSV变异株感染试验组10头猪。组织病理学变化表明,攻毒猪在第9天以渗出性炎症为主,第14天出现典型的间质性肺炎变化,第28天肺脏间质性肺炎病变基本消失。扫描电镜观察表明攻毒猪第9天肺泡壁破坏严重,肺泡腔内有大量细胞成分;第14天肺泡壁增厚,肺泡间隔出现大量增生的细胞成分,肺泡内壁粗糙并粘附着许多细胞成分。结合组织病理学和扫描电镜同步观察猪高致病性PRRS肺组织的结构变化为研究高致病性PRRSV侵害肺脏组织的机理开辟了一条新途径。

两株高致病性PRRSV ORF6和ORF7基因克隆及序列分析

应用RT—PCR方法从实验室分离的两株高致病性PRRSV SX、ZQ株中扩增出ORF6和ORF7，将其分别克隆、测序。用DNAStar软件分析所测序列，并与VR-2332株、LV株、周边国家及国内分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较，并绘制系统进化树，结果ORF6、ORF7核苷酸与北美洲型的同源性为91．1％～100％，与欧洲型的同源性为66．2％～70．7％，推导氨基酸与北美洲型的同源性为91．2％～100％，与欧洲型的同源性为62．3％～82．3％。证明新分离到的PRRSVSX株、ZQ株仍属北美洲型。SX株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99．8％、100％；ZQ株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99．6％、99．7％。

高致病性PRRSV N_(SP)2基因的扩增与分析

利用软件Oligo6.0设计1对针对PRRSV NSP2基因的特异性引物,对已检测为PRRSV阳性的病料进行PRRSV NSP2基因扩增及测序。应用DNAstar软件将所测序列与VR-2332毒株、CH-1a毒株(2001)进行比对,发现JXYC与JXNC毒株的核苷酸序列都有87个碱基连续缺失,在与JX2毒株(2007)VR-2332毒株进行比对时发现有相同的缺失,这说明PRRSV已经发生重大变异,而高致病性PRRSV变异不大。该研究补充和丰富了PRRSV毒株的基因组信息数据及PRRSV的分子流行病学的内容。

高致病性PRRSV SC-JX01株Nsp2基因的序列分析和抗原表位预测

将扩增SC-JX01株得到的Nsp2基因cDNA片段克隆于pMD-T载体中。提取pMD-Nsp2质粒,测序后利用DNAStar软件进行序列分析。结果表明,SC-JX01株Nsp2基因与GenBank已发表的高致病性PRRSV Nsp2基因序列的相似性为98.1%~99.1%,氨基酸的相似性为95.9%~98.0%,具有相同的30个氨基酸缺失。本研究表明,SC-JX01株Nsp2基因与分离自不同地区高热病毒株的Nsp2基因序列具有相同的缺失。由于SC-JX01株的Nsp2基因存在氨基酸的缺失,与VR2332株比较,其亲水性、抗原指数均发生了大的变化。

高致病性PRRSV浓缩灭活疫苗的研制及免疫效果

[目的]研制高致病性PRRSV浓缩灭活疫苗。[方法]分别以病毒液、病毒浓缩液作为抗原,以甲醛、β-丙内酯为灭活剂,制成A、B、C、D 4种灭活疫苗,进行物理性状和无菌检验,安全检验合格后,与商品疫苗E进行免疫效果比较。[结果]4种疫苗均有良好的安全性。免疫后35 d,未浓缩抗原的A、C疫苗及商品疫苗E组抗体均未阳转,浓缩抗原的B、D疫苗组抗体阳转率分别达到80%和100%。[结论]浓缩病毒液制成的灭活疫苗比未浓缩病毒液制成的灭活疫苗及商品疫苗具有较好的免疫效果。

一个猪场高致病性PRRSV的分离鉴定

本研究对一个猪场高致病性PRRSV疑似病例进行了病理剖检、PRRSV N蛋白基因RT-PCR扩增以及序列测定和分析。结果表明,N2号分离株N蛋白核苷酸序列与高致病性毒株(JXA1株、Hu N4株、SX-1株、TJM株)的一致性均为99.1%,N3/N4号与高致病性毒株的一致性均为98.9%,由此判定该猪场病猪感染毒株为高致病性PRRSV。该研究结果可为养猪生产中高致病性PRRSV感染的判断提供借鉴。

高致病性PRRSV河南分离株ORF6基因的克隆与遗传进化分析

猪繁殖与呼吸障碍综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）引发的猪的一种病毒性传染病，主要临床症状为怀孕母猪早产、流产、产木乃伊胎，以及仔猪呼吸道症状和高死亡率。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒样品对细胞的敏感性

从疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的发病猪场采集组织和血清样品并按病料分成2组,通过反转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测样品中高致病性PRRSV发生变异的Nsp2部分基因,初步筛选出PRRSV阳性样品后分别通过Marc-145和PAM细胞分离培养。结果表明:从45份阳性病料中成功分离到29份高致病性PRRSV,其中从血清样品中成功分离的约占总数72.5%,从组织样品中成功分离的约占总数27.5%;通过Marc-145细胞分离获得的病毒有19份,通过PAM细胞分离获得的有24份,其中有14份是Marc-145和PAM共同分离得到。试验获得的血清是高致病PRRSV分离的理想样品,该病毒对Marc-145和PAM细胞的敏感性差异不显著。

山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征

采用RT-PCR技术对2001-2007年分离自山东地区10株（ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7）猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析。结果表明：该10株病毒仍属北美洲型,其中2001-2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株（VR-2332株）和疫苗毒MLVRe-spPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006-2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD3,SD4,SD5,SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%-100%,99.4%-99.8%,99.2%-99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株（JXA1、Shanghai、HEB1）同属一个大的分支。首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势。

反向遗传学技术在PRRSV基础与应用领域中的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种球形、带囊膜的病毒。其基因组为单股正链、不分节段的RNA,大小约为15 kb[1-3],包含10个开放阅读框。PRRSV主要造成妊娠母猪流产、死胎和仔猪呼吸道疾病,高致病性PRRSV(HP-PRRSV)甚至能引起各日龄的猪发病。根据病毒基因组和GP5的抗原性差异,可将PRRSV分为PRRSV-I和PRRSV-II,我国常见的是以NADC30-like、 HP-PRRSV为代表的PRRSV-II[4]。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)临床免疫效果的研究

为评价高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)的临床免疫效果,分别选择PRRS阴性猪场、PRRS免疫阳性猪场和PRRS野毒感染猪场进行免疫接种研究,接种剂量分别为1头份和2头份,接种后观察猪群临床症状,监测抗体水平并抽取部分仔猪进行攻毒试验。结果表明:PRRS阴性猪场和PRRS免疫阳性猪场接种TJM-F92株疫苗后,仔猪保育阶段成活率、育肥阶段成活率、出栏率及母猪窝产健活仔数与未免疫猪比较无明显差异,仔猪免疫后第28天攻毒保护率均为80%。PRRS野毒感染猪场接种疫苗后仔猪保育阶段成活率、育肥阶段成活率、出栏率及母猪窝产健活仔数均明显提高。说明高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)具有较好的临床保护效果。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白B细胞表位预测与分析

为了预测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP—PRRSV）GP5蛋白B细胞表位，试验以HP—PRRSVGP5基因组序列为基础，采用Kyte—Doolittle方案、Emini方案和Jameson—wolf方案，辅以Gamier—Robson方法、Chou—Fasman方法和Karplus—Schulz方法对HP—PRRSVGP5蛋白的二级结构柔性区域进行分析，预测HP—PRRSVGP5蛋白B细胞表位，并与相关文献报道的表位进行比对。结果表明：最有可能的B细胞表位位于GP5蛋白N端第31～37，51～56，136～141，148～156，163—166，193～200区段，并发现了新的表位。

呼吸道综合症病猪群病原检测与分析

应用PCR技术和免疫荧光试验对福建省某猪场以呼吸道症状为主的发病猪群进行多重病原检测和人工感染病猪肺脏淋巴结等器官的病理组织学观察。结果显示:病猪肺脏和淋巴结等病料匀浆的RT-PCR检测为PRRSV变异株阳性,但PRV、CSFV、PCV2及SIV均为阴性;免疫荧光试验结果与RT-PCR一致;将阳性病料接种Marc-145分离到1株病毒,人工感染断奶仔猪能复制出与临床自然病猪相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒;病理组织学观察显示人工感染濒死猪肺脏呈间质性肺炎病变。综合分析上述结果初步表明该猪群暴发的呼吸道疾病主要是由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异型引起。

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及其基因测序

2006年，我国爆发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP—PRRSV），给养猪业造成了严重的经济损失，该HP-PRRSV在Nsp2区有30个氨基酸的不连续缺失。分子流行病学调查证实，目前我国流行的PRRSV毒株主要是HP—PRRSV毒株。2011年，从山东某猪场成功分离到2株PRRSV，分别命名为PRRSV-SDA2和PRRSV—SDA3；基因测序结果显示PRRSV-SDA2全长为15349bp，PRRSV-SDA3全长为15350bp。通过与涵盖欧洲型和北美型的24个毒株全基因比对，发现这2个毒株均属于北美型HP—PRRSV，与HuN4毒株的同源性最高，均高达99．5％，其NSP2蛋白的482和533～561位缺失了30个氨基酸。成功分离的SDA2和SDA32个HP—PRRSV及完成的基因测序，为构建HP—PRRSV毒株的感染性克隆奠定了基础。

对PRRSV快速分型的多重RT-PCR方法的建立与应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的Nsp2基因间的差异,设计3对特异性扩增引物,建立快速检测PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的多重RT-PCR方法。利用PRRSV欧洲株、经典株和高致病性Nsp2变异株及其他相关病毒株进行敏感度和特异性试验。结果显示,所建立的多重RT-PCR对欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的RNA最小检出量分别为0.050 2、0.055 4、0.056 4ng,与CSFV、TGEV、JEV、SIV的核酸均无交叉反应。用该方法检测病料76份,结果PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的阳性率分别为0、7.89%和53.9%,未发现3型病毒间有混合感染的情况。检测结果与单一RT-PCR及RT-PCR检测试剂盒检测结果一致,高于病毒分离。

靶向HP-PRRSV ORF7基因的siRNA重组伪狂病病毒的体外复制抑制效果

为了评价靶向高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）ORF7的siRNA重组伪狂犬病病毒（rPRV）对HP-PRRSV复制的体外抑制效果。将500MOI的siRNA rPRV：rPRV gG-/siRNA N1、rPRV gG-/siRNA N2、rPRV gG-/siRNA N3分别感染Marc-145细胞,24h后再分别接种10 MOI PRRSV,感染病毒48h后,观察其抑制HPPRRSV HN1株复制效果;待细胞感染病毒72h后,应用间接免疫荧光试验（IFA）、实时荧光定量PCR及Western blot检测重组rPRV介导的siRNA对HP-PRRSV在细胞中复制的抑制作用。结果显示,与表达突变siRNA的rPRV gG-/siRNA Neg及接毒对照组相比,HP-PRRSV在细胞中的复制均可被3个siRNA rPRV有效抑制,其中重组病毒rPRV gG-/siRNA N2抑制效果最佳;进一步检测siRNA重组rPRV在Marc-145细胞中抑制HP-PRRSV HN1株的复制效果,结果显示,与对照组相比,重组病毒rPRV gG-/siRNA N1和rPRV gG-/siRNA N3抑制作用不明显,而rPRV gG-/siRNA N2不但能够有效抑制HP-PRRSV引起的细胞病变,而且能够消减HP-PRRSV N蛋白的表达,明显降低ORF7mRNA的表达水平（P〈0.05）,且其抑制作用具有剂量依赖性,其抑制效果至少可持续5d,但随着时间的延长逐渐减弱。结果提示siRNA rPRV在体外能抑制HP-PRRSV的复制。