蛋白药物开发高表达细胞株筛选技术的进展

常见的真核表达细胞包括Chinese hamster ovary （CHO）,mouse myeloma（NS0）,baby hamster kidney（BHK）,human embryo kidney（HEK-293）,其中最重要的是CHO细胞,以CHO dihydrofolate reductase （DHFR）系统[1]和CHOglutamine synthetase （GS）系统[2]为主.获得产量高、稳定、生长快等优良特征的克隆用于生产蛋白药物或蛋白抗体的细胞系是一项具有挑战性的工作.转染细胞在抗生素药物筛选后,使用MTX（CHO DHFR）系统和MSX（CHO GS）系统进一步筛选得到转染阳性细胞集群.本文介绍几种常见的从上述的细胞集群里获得高表达细胞株的方法,由于流式细胞仪逐渐成为实验室的常规仪器,本文以流式细胞仪在这方面的应用为主加以介绍。

N-乙酰氨基半乳糖转移酶3高表达细胞株的建立及其对细胞迁移的影响

蛋白质异常糖基化是导致细胞黏附、肿瘤转移和血管生成的重要因素[1-2].N-乙酰氨基半乳糖转移酶3（GalNAc-T3）能够催化N-乙酰氨基半乳糖连接到蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上,是黏蛋白型O-糖基化修饰的起始糖基转移酶.我们前期的研究成果显示,在低表达GalNAc-T3肺腺癌组织内,肿瘤细胞分化程度较低,预后较差[3].我们利用慢病毒载体,构建高表达GalNAc-T3肺腺癌A549细胞株,观察GalNAc-T3的表达对肺腺癌转移的影响.

人PD-L1真核表达载体的构建及结肠癌细胞稳定表达单克隆株的筛选和鉴定

目的:构建人程序性死亡配体1(PD-L1)重组质粒载体,筛选稳定高表达人PD-L1的结肠癌单克隆细胞株。方法:提取HCT116细胞总RNA,RT-PCR克隆PD-L1基因片段,将其重组至含有HA标签和Neo真核细胞筛选抗性的pc DNA3质粒载体上,转染HCT116细胞,倍比稀释8个细胞浓度至96孔板,G418筛选两周,挑取单细胞克隆,通过免疫印迹鉴定外源性PD-L1的表达;通过MTS、Transwell和软琼脂细胞克隆形成实验比较PD-L1低表达和高表达单克隆细胞株生长增殖、迁移和细胞克隆形成能力的差别;最后通过在两组细胞中过表达帽依赖性荧光素酶报告基因阐述造成上述表型的可能机制。结果:成功构建人PDL1的真核表达载体,并筛选获得稳定高表达PD-L1的HCT116单克隆细胞株。功能研究初步证明PD-L1可促进细胞克隆形成能力、迁移和生长增殖。过表达PD-L1可使帽依赖性荧光素酶报告基因的表达上调约3~4倍,表明其机制部分为PD-L1可上调帽依赖性蛋白质翻译。结论:获得了PD-L1重组质粒载体及可用于后续功能研究的稳定高表达人PD-L1的HCT116单克隆细胞株。

药用植物细胞的大规模培养技术

对药用植物细胞和器官进行大规模培养生产各种次生代谢药物的技术进行了简要介绍。