RNAi抑制高迁移率族蛋白B2表达对人肝癌细胞HepG2迁移及侵袭能力的影响及机制

目的采用RNA干扰技术下调肝癌细胞中高迁移率族蛋白B2(HMGB2)的表达,观察其对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响,并阐明其作用机制。方法体外培养人肝癌细胞HepG2,分为HMGB2 RNA干扰组(HMGB2 siRNA)及阴性对照组(NC),分别以脂质体2000为载体,转染敲除HMGB2序列的RNA寡核苷酸(RNA oligo)及RNA干扰无关序列。采用RT-qPCR及Western blot法检测细胞中HMGB2 mRNA及蛋白表达水平以验证干扰效果;采用细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测敲低HMGB2对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响;Western blot法检测敲低HMGB2对HepG2细胞EMT相关蛋白表达的影响。结果HMGB2 siRNA组细胞HMGB2 mRNA及蛋白表达水平低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05),表明RNA干扰成功;细胞划痕及Transwell侵袭实验结果显示,HMGB2 siRNA组细胞愈合率及侵入小室的细胞数量少于NC组,差异有统计学意义(P<0.05),表明下调HMGB2表达可降低HepG2细胞的迁移及侵袭能力;Western blot结果显示,HMGB2 siRNA组HepG2细胞N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白表达水平低于NC组,E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平高于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论下调HMGB2表达可抑制肝癌细胞的上皮间质转化进程,进而降低其迁移及侵袭能力。

结直肠癌组织中HMGB2、MAGE-A9、MMR蛋白表达及其临床意义

目的探讨结直肠癌组织中高迁移率族蛋白B2(HMGB2)、黑色素瘤相关抗原-A9(MAGE-A9)、DNA错配修复基因(MMR)蛋白表达情况,以及其在评估患者预后中的临床价值。方法选取52例结直肠癌患者作为研究对象,术中采集所有患者肿瘤标本及癌旁组织标本,检测HMGB2、MAGE-A9、MMR蛋白表达水平,并分析各指标表达情况与病理特征、预后间的关系。结果肿瘤组织内HMGB2、MAGE-A9、MMR阳性表达高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤分期Ⅲ期、分化程度低分化、淋巴结转移患者HMGB2、MAGE-A9、MMR阳性表达率高于Ⅰ期、Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移患者,差异有统计学意义(P<0.05)。随访3年,52例患者存活率为71.15%(37/52);HMGB2阳性组存活率[61.76%(21/34)]低于HMGB2阴性组[88.89%(16/18)],差异有统计学意义(χ^(2)=4.219,P=0.040);MAGE-A9阳性组存活率[58.62%(17/29)]低于MAGE-A9阴性组[86.96%(20/23)],差异有统计学意义(χ^(2)=5.018,P=0.025);MMR阳性组存活率[52.00%(13/25)]低于MMR阴性组[88.89%(24/27)],差异有统计学意义(χ^(2)=8.606,P=0.003)。结论HMGB2、MAGE-A9、MMR在结直肠癌中呈高表达状态,其表达与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移关系密切,且不同表达患者存活率存在较大差异,可作为评估预后的重要指标。

基于成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9技术的高迁移率族蛋白B2基因敲除巨噬细胞Raw264.7细胞株的构建与功能鉴定

目的通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7), 并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA), 将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞, 利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2-/- Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力, 通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2-/- Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用t检验。结果利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株, HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达, HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较, 差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15, t=0.17, P>0.05), 但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%, t=5.62, P<0.01];KP感染HMGB2-/- Raw264.7, 促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml, t=5.00, P<0.01;(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml, t=3.36, P<0.01;(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml, t=3.68, P<0.05]。结论通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株, 验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

幽门螺杆菌感染及病灶组织内TLR4、HMGB2在结直肠息肉和结直肠癌中的差异性分析及临床意义探讨

目的 分析幽门螺杆菌(Hp)感染及病灶组织内Toll样受体4(TLR4)、高迁移率族蛋白B2(HMGB2)在结直肠息肉和结直肠癌中的差异性并探究其临床意义。方法 选取2020年1月~2022年2月某院100例结直肠息肉患者与50例结直肠癌患者,结直肠息肉患者中增生性息肉58例,腺瘤性息肉42例。对结直肠息肉与结直肠癌患者进行全结肠检查,记录息肉样病变部位、形态、大小与肿瘤位置;肠镜检查后1周内对其实施胃镜检查,取其胃黏膜组织进行快速尿素酶试验检测Hp感染情况;取研究对象病灶组织,采用免疫组化法检测其TLR4、HMGB2表达;采用Logistic回归模型分析结直肠癌的危险因素。结果 直肠息肉直径<1 cm患者Hp感染率低于直径≥1 cm患者(P <0.05),单发息肉感染率低于多发息肉患者(P <0.05)。结直肠癌患者左半结肠+直肠与右半结肠Hp感染率差异无统计学意义(P> 0.05)。结直肠癌组织中TLR4、HMGB2阳性表达率高于结直肠息肉组织(P <0.05),且息肉组织中腺瘤性息肉TLR4、HMGB2阳性表达率高于增生性息肉(P <0.05)。Logistic回归分析显示,Hp感染、TLR4及HMGB2阳性表达为结直肠癌发生的危险因素(P <0.05)。结论 结直肠息肉患者体内Hp感染与息肉大小、数量有关,结直肠癌患者Hp感染与肿瘤位置无关,且结直肠癌组织中TLR4、HMGB2阳性表达多于结直肠息肉组织。

HMGB2对肺腺癌细胞周期和增殖的影响

目的:探讨高迁移率族蛋白B2(HMGB2)对肺腺癌细胞周期和增殖的影响。方法:从Cancer RNA-Seq Nexus (CRN)数据库分析肺腺癌组织HMGB2表达情况;从OncoLnc数据库分析HMGB2与肺腺癌患者预后的相关性;从肿瘤单细胞数据库(CancerSEA)分析HMGB2与肺腺癌细胞14种功能状态的相关性;利用siRNA技术下调人肺腺癌A549细胞中HMGB2表达,通过real-time PCR和Western blot验证沉默效果,CCK8和EdU实验检测细胞的增殖。结果:HMGB2在肺腺癌中高表达;HMGB2高表达组肺腺癌患者的总生存期明显低于HMGB2低表达患者(log-rank检验P=0.017 3);HMGB2表达与肺腺癌细胞周期和增殖呈正相关;敲减HMGB2表达后A549细胞的活力和增殖能力显著降低(P<0.05)。结论:HMGB2的表达与肺腺癌细胞周期和增殖显著正相关,可以作为潜在的评估肺腺癌患者预后的标志物和治疗靶标。

靶向miR-188-3p/HMGB2抑制circ_0008035对肺癌细胞生物行为的影响

目的探讨环状RNA_0008035(circ_0008035)对肺癌细胞生物行为的影响及分子机制。方法应用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定25例肺癌组织中circ_0008035和miR-188-3p表达。在A549细胞中转染si-NC(si-NC组)、si-circ_0008035(si-circ_0008035组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-188-3p mimics(miR-188-3p组),或共转染si-circ_0008035和anti-miR-188-3p(si-circ_0008035+anti-miR-188-3p组)。另设正常培养的A549细胞为对照(con组)。采用Western blot测定高迁移率族蛋白B2(HMGB2)表达,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测定细胞增殖,平板克隆形成试验测定细胞克隆形成,流式细胞术测定细胞凋亡率,双荧光素酶活性检测分析circ_0008035与miR-188-3p、miR-188-3p与HMGB2之间的靶向关系。结果肺癌组织中circ_0008035表达较癌旁组织增加,miR-188-3p表达较癌旁组织减少(P<0.05)。与con组或si-NC组相比,si-circ_0008035组circ_0008035表达、HMGB2蛋白表达、克隆形成数减少,miR-188-3p表达、细胞抑制率与凋亡率增加(P<0.05)。与con组和miR-NC组相比,miR-188-3p组miR-188-3p表达、细胞抑制率与凋亡率增加,HMGB2蛋白表达、克隆形成数减少(P<0.05)。circ_0008035靶向miR-188-3p,miR-188-3p靶向HMGB2。si-circ_0008035+anti-miR-188-3p组miR-188-3p表达、细胞抑制率与凋亡率比si-circ_0008035组低,HMGB2蛋白表达、克隆形成数比si-circ_0008035组高(P<0.05)。结论抑制circ_0008035通过靶向miR-188-3p/HMGB2,抑制肺癌细胞增殖,和诱导细胞凋亡。

HMGB2启动子报告基因载体的构建、活性验证及与其结合的转录因子的预测

目的:构建高迁移率族蛋白B2(high mobility group box2,HMGB2)启动子荧光素酶报告基因载体,并对其进行活性验证,预测可能与HMGB2启动子结合的转录因子。方法:在NCBI Genbank数据库中查询HMGB2基因启动子区域序列,运用PCR扩增HMGB2启动子序列片段,将其克隆至pGL3-Basic载体中,构建重组质粒pGL3-HMGB2-promoter,并通过双酶切和测定核酸序列鉴定。采用虫荧光素酶报告实验验证pGL3-HMGB2-promoter重组质粒的活性,进一步通过在线软件PROMO预测可以与HMGB2启动子序列结合的转录因子。结果:经限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列比对,证实pGL3-HMGB2-promoter重组质粒构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,构建的重组质粒具有启动子活性。PROMO在线软件分析结果表明,有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合。结论:成功构建了含有HMGB2启动子序列的荧光素酶报告基因重组质粒,该质粒具有启动子活性,且有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合,促进HMGB2的转录。

双氢青蒿素通过抑制HMGB2表达及逆转EMT进程抑制肝癌细胞生长及侵袭

目的:观察双氢青蒿素(DHA)对体外生长的肝癌细胞生物学行为的影响,并探讨其作用机制。方法:体外培养人肝癌细胞HepG2和LM3,采用不同浓度DHA处理,设立不加药的阴性对照组并以顺铂作为阳性对照。MTT、流式细胞术分别检测DHA对肝癌细胞增殖及凋亡的影响;划痕实验、Transwell实验分别观察DHA对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响;Western blot检测DHA对肝癌细胞凋亡相关蛋白、HMGB2及EMT相关蛋白表达的影响。结果:与阴性对照组相比,DHA处理后的肝癌细胞存活率降低、凋亡率提高,迁移及侵袭能力降低(P<0.05),HMGB2蛋白表达显著降低,凋亡相关蛋白Cleavedcaspase3、Bax表达显著增加,Bcl-2表达显著减少,EMT相关蛋白E-cadherin表达显著增加,N-cadherin、Vimentin表达显著减少(P<0.05)。结论:DHA可抑制肝癌细胞生长,促进其凋亡,降低其迁移及侵袭能力,其机制可能为DHA通过降低HMGB2表达抑制肝癌细胞EMT进程。

退变腰椎间盘髓核组织HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ的表达及相关性

目的探讨腰椎间盘髓核组织高迁移率族蛋白B2(HMGB2)、淋巴样增强因子-1(LEF-1)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)mRNA及蛋白表达水平及其临床意义。方法收集腰椎间盘突出症患者手术摘除的髓核组织标本20例,根据术前腰椎MR片Pfirrmann分级标准均分为轻度退变组和重度退变组。qRT-PCR和Western boltting检测两组髓核组织HMGB2、LEF-1、ColⅡ的mRNA及蛋白表达水平,并分析其相关性。结果与轻度退变组比较,重度退变组HMGB2 mRNA及蛋白、COLⅡmRNA降低(P<0.05),LEF-1 mRNA升高(P<0.05)。HMGB2水平与ColⅡ水平呈正相关,与LEF-1水平呈负相关(P<0.05);LEF-1水平与ColⅡ水平呈负相关(P<0.05)。结论HMGB2、LEF-1、ColⅡ在不同退变程度腰椎间盘髓核组织中表达水平不同,提示其可能与椎间盘退变的发生相关。

HMGB2基因表达对原发性肝癌患者临床病理和预后的影响

目的:探讨高迁移族蛋白B2(HMGB2)在原发性肝癌中的表达及临床意义。方法:从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载人正常肝组织和肝癌组织中的HMGB2基因mRNA二代测序数据及相应的临床病理资料,分析HMGB2在肝癌及正常肝组织的表达差异,结合临床病理及随访资料,采用Kaplan-Meier进行预后分析,采用COX回归进行危险因素的单、多因素分析,并利用GSEA软件进行富集分析。结果:HMGB2 mRNA在肝癌组织中表达量明显高于正常肝组织(P<0. 01);HMGB2高表达与Grade病理分级密切相关,且病理分级越高,HMGB2表达越高(均P<0. 05),HMGB2高表达组肝癌患者总生存率及无病生存率明显低于HMGB2低表达组,差异具有显著性(P<0. 01)。HMGB2和肿瘤TNM分期可作为评价肝癌患者预后的独立危险因素。HMGB2可能参与细胞周期调控、细胞黏附、p53信号通路、基因切除修复等。结论:HMGB2的高表达与肝癌患者的临床病理及预后显著相关,可以作为潜在的评估肝癌患者预后的标志物和肿瘤治疗的靶标。