高迁移率族蛋白质1在心力衰竭患者血清中表达及意义

目的探讨高迁移率族蛋白质1(high mobility group box 1protein,HMGB1)在心力衰竭中的致病作用。方法心力衰竭患者42例,按照NYHA心功能分级分组,心功能Ⅱ级组16例,心功能Ⅲ级组14例,心功能Ⅳ级组12例,心功能正常者20例为对照组。采用酶联免疫法测定HMGB1、脑钠肽前体(pro-brain natriuretic peptide,pro-BNP)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和高敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)。超声检查测定心功能。结果心力衰竭患者各组HMGB1、pro-BNP和TNF-α均较对照组明显升高(P<0.05),随心力衰竭分级加重,上述指标水平升高更明显,两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);血清HMGB1与pro-BNP、TNF-α、hs-CRP、左室射血分数水平呈正相关(r=0.630,P=0.043;r=0.560,P=0.046;r=0.540,P=0.048;r=0.670,P=0.041)。结论 HMGB1水平升高对心力衰竭的诊断及病情评估有重要价值。

硫酸镁对脂多糖诱导巨噬细胞表达和释放高迁移率族蛋白1的影响

目的探讨硫酸镁对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7表达和释放高迁移率族蛋白1(HMGB1)的抑制作用。方法传代培养的小鼠RAW264.7细胞分5组接种于6孔板,每组为3孔。C组为仅加RPMI 1640培养液的对照组,LPS组为在RPMI 1640培养液的基础上加500ng/mL LPS的诱导组,M1组为在LPS组基础上加1mmol/L硫酸镁的干预组,M5组为在LPS组的基础上加5mmol/L硫酸镁的干预组,M10组为在LPS组基础上加10mmol/L硫酸镁的干预组。孵育24h后,收集细胞及细胞培养上清液,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测各组细胞内HMGB1mRNA表达水平和细胞培养上清液中HMGB1蛋白含量的变化。结果 M1、M5、M10组的RAW264.7细胞活性分别为1.35±0.10、1.34±0.11、1.31±0.08,差异均无统计学意义(P值均>0.05)。LPS、M1、M5、M10组细胞上清液中HMGB1蛋白的含量分别为(82.80±9.15)、(81.26±8.47)、(56.69±6.21)、(50.71±6.62)ng/mL,均显著高于C组(C组为0,P值均<0.05);M5、M10组细胞上清液中HMGB1蛋白的含量均显著低于LPS及M1组(P值分别<0.05或0.01)。LPS、M1、M5、M10组细胞中HMGB1 mRNA的相对表达量分别为1.435±0.161、1.416±0.124、0.873±0.093、0.774±0.067,均显著高于C组的0.195±0.020(P值均<0.05);M5、M10组细胞中HMGB1mRNA的相对表达量均显著低于LPS及M1组(P值分别<0.05或0.01)。结论硫酸镁抑制LPS诱导的RAW264.7细胞表达和释放HMGB1,通过抑制与脓毒症致死性密切相关的关键炎性因子,可能对脓毒症患者具有一定保护作用。

低镁对脂多糖诱导巨噬细胞表达和释放高迁移率族蛋白1的影响

目的探讨低镁对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7表达和释放高迁移率族蛋白1(HMGB1)的促进作用。方法传代培养的小鼠RAW264.7细胞分为4组,接种于6孔板,每组为3孔,4组分别为含1mmol/L硫酸镁的RPMI1640培养基组(C1组)、含0.1mmol/L硫酸镁的RPMI1640培养基组(C0.1组)、含1mmol/L硫酸镁的RPMI1640培养基加500ng/mLLPS的刺激组(L1组)和含0.1mmol/L硫酸镁的RPMI1640培养基加500ng/mLLPS的刺激组(L0.1组)。孵育24h后,收集细胞及细胞培养上清液,用反转录-聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验分别检测各组细胞内HMGB1mRNA表达水平和细胞培养上清液中HMGB1蛋白含量的变化。结果 C0.1组与C1组间HMGB1mRNA及蛋白表达的差异均无统计学意义(P值均>0.05),L1组和L0.1组HMGB1mRNA及蛋白的表达均显著高于C0.1组和C1组(P值均<0.05),L0.1组又显著高于L1组(P值均<0.05)。结论低镁促进LPS诱导的RAW264.7细胞表达和释放HMGB1,可能对脓毒症患者的预后有一定损害作用。

高迁移率族蛋白B1与急性心肌梗死的相关性分析

目的探讨血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)水平与急性心肌梗死(AMI)的关系。方法选取2016年1月—2018年11月于东南大学医学院附属江阴医院就诊并成功行急诊冠状动脉介入治疗的急性ST段抬高型心肌梗死患者348例,选取同期该院健康体检群众312例。记录患者从开始发病至球囊开通时间的血清HMGB1、总胆固醇、甘油三酯、LDL、HDL、肌钙蛋白I、脑钠肽(BNP)水平,通过二维超声心动图检查记录左室舒张末期内径(LVEDD)及左室射血分数(LVEF)。结果AMI组HDL、LVEF较对照组低(P<0.05),LDL、BNP、LVEDD及HMGB1较对照组高(P<0.05)。血清HMGB1水平与球囊开通时间、LDL、BNP水平、LVEDD及肌钙蛋白Ⅰ呈正相关(r=0.896、0.667、0.647、0.623和0.781,均P<0.05),与HDL、LVEF呈负相关(r=-0.774和-0.739,均P<0.05)。AMI组HMGB1水平较对照组高(P<0.05)。HMGB1诊断曲线下面积为0.76(95%CI:0.69,0.82),HMGB1用来预测AMI后再发心房颤动的界值为7.28μg/L,敏感性为72%(95%CI:0.67,0.77),特异性为62%(95%CI:0.57,0.67)。结论血清HMGB1水平与AMI具有明显的相关性,并对AMI后心房颤动的发生具有诊断价值,通过监测血清HMGB1水平对AMI的诊治具有一定的临床指导意义。

凉膈散对内毒素致急性肺损伤大鼠高迁移率族蛋白1影响

目的观察凉膈散对内毒素脂多糖(LPS)致急性肺损伤(ALI)大鼠高迁移率族蛋白1(HMGB1)表达的影响,探讨凉膈散治疗ALI的抗炎机制。方法选取健康雄性SD大鼠72只,随机分为6组,每组12只,分别为正常对照组、ALI模型组、凉膈散大剂量组、凉膈散中剂量组、凉膈散小剂量组和泼尼松治疗组。给予正常对照组大鼠气管内滴注生理盐水,其余各组大鼠均气管内滴注LPS,每天一次,连续2 d,气道内滴注1 h后分别以生理盐水、凉膈散不同剂量、泼尼松灌胃,每天2次。分别于第二次气管滴注后12 h、24 h每组处死6只。取肺组织,采用荧光定量PCR和Western blot检测HMGB1基因和蛋白的表达,各组指标的均数比较均采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果 12 h肺组织HMGB1 mRNA灰度值模型组(1.365 5±0.449 2)高于正常对照组(0.389 8±0.169 6)(P<0.01),泼尼松组(0.600 8±0.212 8)、凉膈散大剂量组(0.670 7±0.217 5)、中剂量组(0.731 5±0.200 1)、小剂量组(0.799 3±0.552 6)均低于模型组(1.365 5±0.449 2)(P<0.01),HMGB1相对光密度值模型组(30.03±0.15)高于正常对照组(12.20±0.10)(P<0.01),泼尼松组(13.47±0.25)、凉膈散大剂量组(15.70±0.20)、中剂量组(18.60±0.20)、小剂量组(22.47±0.25)均低于模型组(30.03±0.15)(P<0.01);24 h肺组织HMGB1 mRNA灰度值模型组(1.710 9±0.802 8)高于正常对照组(0.691 8±0.245 3)(P<0.01),泼尼松组(0.727 0±0.097 7)、凉膈散大剂量组(0.782 5±0.178 0)、中剂量组(0.943 3±0.113 6)、小剂量组(1.125 5±0.213 7)均低于模型组(1.710 9±0.802 8)(P<0.01或P<0.05),HMGB1相对光密度值模型组(30.63±0.25)高于正常对照组(10.27±0.31)(P<0.01),泼尼松组(13.63±0.15)、凉膈散大剂量组(18.63±0.21)、中剂量组(22.57±0.21)、小剂量组(24.53±0.32)均低于模型组(30.03±0.15)(P<0.01或P<0.05)。结论凉膈散可抑制肺组织HMGB1蛋白及mRNA表达,从而减轻ALI肺部炎症反应。

异丙酚对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞表达释放高迁移率族蛋白1的抑制作用

目的 探讨异丙酚对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠巨噬细胞RAw 264.7表达和释放高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1 protein,HMGB1）的抑制作用.方法 检测LPS刺激后,传代培养的小鼠RAW 264.7细胞表达分泌HMGB1的时间梯度,确定RAW 264.7细胞表达分泌HMGBl浓度最高的时间点.随后将RAW 264.7细胞分3组接种于6孔板,每组为两孔：即仅加培养液的对照组（control组）;加250μg/L LPs的诱导组（LPS组）;加250μg/L LPS基础上加50 μmol/L异丙酚的干预组（LPS＋异丙酚组）.培养至HMGB1表达分泌浓度最高的时间点后,收集细胞及细胞培养上清,用RT-PCR和Westem blot法分别检测各组细胞内HMGB 1 mRNA表达水平和HMGB1蛋白表达水平,用Westem blot法检测细胞培养上清中HMGB1含量的变化.结果 LPS刺激RAW 264.7细胞后16 h,HMGB1表达达到高峰,随后有所下降;加入异丙酚干预后,细胞HMGB1表达及释放显著低于LPS刺激组（P〈0.05）;LPS刺激RAW 264.7细胞后16 h,HMCB1 mRNA表达水平明显增强,而加入异丙酚干预后,则明显抑制HMGB1 mRNA表达水平.各组细胞中HMCB1蛋白含量变化和mRNA水平变化一致.结论 异丙酚抑制LPS诱导的RAW264.7细胞表达和释放HMGBl,可能对LPS血症具有一定保护作用.

HMGB1在TNF-α诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖中的作用及机制

目的:探讨HMGB1在TNF-α诱导的大鼠滑膜RSC-364细胞增殖中的作用及机制。方法:将常规培养的RSC-364细胞分为正常对照组和10μg.L-1TNF-α刺激组,分别于6 h、12 h、24 h收集细胞。RT-PCR检测HMGB1、STAT1和STAT3 mRNA的表达;免疫细胞化学和流式细胞术检测HMGB1、PCNA、STAT1和STAT3蛋白表达。结果:①TNF-α能显著上调HMGB1 mRNA和蛋白的表达,同时PCNA蛋白表达也增强(P<0.05或P<0.01)。②TNF-α作用12 h后,STAT1 mRNA和蛋白的表达明显增强,24 h表达最高(P<0.01)。③TNFα作用6 h-24 h对STAT3 mRNA和蛋白的表达无明显影响(P>0.05)。④HMGB1蛋白表达与PCNA、STAT1蛋白表达呈正相关;STAT1与PCNA蛋白表达亦呈正相关。结论:TNF-α可能通过诱导RSC-364细胞高度表达HMGB1,促进滑膜细胞增殖;STAT1可能参与了其信号转导及调控过程。

HMGB1对大鼠类纤维母细胞样滑膜细胞STAT/SOCS/cyclin D1表达的影响

目的:探讨高迁移率族蛋白(HMGB)1对大鼠滑膜细胞STAT/SOCS信号通路的调控作用。方法:将常规培养大鼠滑膜细胞株RSC-364细胞随机分为正常对照组和10μg/L HMGB1刺激组,分别培养6 h、12 h和24 h后,RT-PCR检测STAT1/3 mRNA的表达,Western blotting法检测磷酸化STAT(p-STAT)1/3和STAT1/3蛋白的表达,流式细胞术(FCM)检测p-STAT1/3、SOCS 1/3和cyclin D1蛋白的表达。结果:HMGB1呈时间依赖性上调STAT1 mRNA和蛋白的表达,以及cyclin D1蛋白的表达,并能明显增加p-STAT1的水平(P<0.01),但STAT3的表达以及p-STAT3的量与对照相比无明显差异。HMGB1刺激后还能明显增加细胞SOCS1的蛋白水平,但SOCS3蛋白仅于6 h呈一过性增高。结论:HMGB1能激活STAT1信号转导通路,并上调cyclin D1基因表达,这可能与HMGB1促进滑膜细胞的增殖有关。

p38MAPK在周期性机械牵张诱导肺泡巨噬细胞表达HMGB1中的作用

目的:研究p38 MAPK在周期性机械牵张诱导肺泡巨噬细胞(AM)表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中的作用。方法:大鼠AM随机分为A、B、C3组,A组为对照组;B组细胞施加20%牵张应变,牵张时间为4h;C组细胞的牵张模式与B组相同,在牵张前用p38 MAPK特异性抑制剂SB203580(40μmol/L)预处理2h。利用RT-PCR法检测HMGB1 mRNA的表达,Western blotting检测HMGB1蛋白表达和p38 MAPK的活性。结果:与对照组相比,AM施加20%牵张应变可诱导HMGB1蛋白和mRNA表达明显增加、p38 MAPK活性明显增高(均P<0.05),SB203580可显著抑制牵张应变的这种诱导作用(均P<0.05)。结论:周期性机械牵张可能通过p38 MAPK信号通路,调节肺泡巨噬细胞HMGB1 mRNA和蛋白的表达。

烟碱抑制RAW264.7细胞表达和释放HMGB1的机制

目的:探讨烟碱抑制RAW264.7细胞HMGB1表达和释放的机制。方法:(1)RAW264.7细胞在6孔板分组培养:仅加培养液为对照组(C);加LPS250μg/L为LPS组(LPS);在LPS基础上加烟碱1μmol/L和10μmol/L分别为烟碱1组(N1)和烟碱2组(N2)。培养24h后,RT-PCR检测各组细胞HMGB1 mRNA表达水平;Western blotting检测上清液和胞浆、胞核HMGB1含量。(2)用鼠α7nAChR基因反义和正义链RNA转染培养细胞后,再加含LPS250μg/L和10μmol/L烟碱于培养液分别作为反义链组(antisense RNA)和正义链组(senseRNA);以上述C组和LPS组为对照,2h后Western blotting检测上清液HMGB1量。结果:(1)C组细胞HMGB1 mRNA呈低水平表达(1659.20±121.05);细胞HMGB1 mRNA表达水平在N1和N2组及LPS组间差异无显著(P>0.05)。(2)LPS组上清液的HMGB1量较高(445.34±28.52);N1和N2组上清液的HMGB1量显著低于LPS组(P<0.05)。(3)C组胞核HMGB1量较高(335.46±12.24);而LPS组胞核HMGB1量明显低于对照组(P<0.05);N1组和N2组胞核HMGB1显著高于LPS组(P<0.05)。(4)AntisenseRNA组与LPS组比,培养液中HMGB1量无显著差异(P>0.05);senseRNA组与LPS组比,HMGB1含量明显减少(P<0.05)。结论:烟碱对RAW264.7细胞释放HMGB1有明显抑制作用;其主要机制可能是通过与α7nAChR特异结合而影响HMGB1的核转位。

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过HMGB1抑制细胞凋亡机制的初步研究

目的探讨pORF5质粒蛋白抗凋亡分子机制,为进一步阐明沙眼衣原体致病机制提供实验依据。方法将HeLa细胞分为两组,一组用凋亡诱导剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)刺激30 min,另一组经pORF5质粒蛋白预处理18 h后,再用CCCP刺激30 min。然后,Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶3(caspase-3)的表达水平;JC-1荧光探针检测HeLa细胞线粒体膜电位变化;间接免疫荧光观察细胞色素c释放情况。为了分析高迁移率族蛋白1(HMGB1)是否参与pORF5质粒蛋白的抗凋亡作用,分别用HMGB1 shRNA和对照RNA稳定转染HeLa细胞,再用pORF5质粒蛋白与CCCP共刺激两种细胞后,测定Bcl-2、Bax和活化的caspase-3蛋白的表达以及细胞色素c的释放情况。两组间比较采用配对样本t检验。结果pORF5质粒蛋白能拮抗CCCP诱导的线粒体膜电位的下降,CCCP单独处理组Hela细胞红/绿荧光强度比率为0.4 ± 0.1,显著低于pORF5与CCCP共处理组(1.7 ± 0.3,t = 6.95,P < 0.01)。与对照组相比,pORF5与CCCP共处理组HeLa细胞Bcl-2蛋白表达水平增加(5.3 ± 0.6)倍(t = 8.62,P < 0.01),而Bax和活化的caspase-3平均表达水平分别降低79%± 10%(t = 9.23,P < 0.01)和75%± 8%(t = 4.26,P < 0.05)。与对照RNA转染组相比,HMGB1 shRNA转染组HeLa细胞线粒体膜电位下降(t = 11.23,P < 0.01),细胞色素c释放增加,Bcl-2的表达水平降低(t = 7.19,P < 0.05),而Bax的表达水平增加(t = 13.06,P < 0.01)。结论沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过HMGB1阻断线粒体凋亡途径发挥抗凋亡作用。

丙酮酸乙酯对脓毒症急性肺损伤大鼠的作用及其机制研究

目的探讨丙酮酸乙酯(EP)对脓毒症急性肺损伤(ALI)大鼠的作用及其可能的作用机制。方法选取健康成年雄性SD大鼠40只,采用随机数字表法分为对照组、假手术组、ALI组和EP组,每组10只。ALI组和EP组采用盲肠结扎穿孔法复制大鼠脓毒症模型,假手术组仅翻动盲肠,不做结扎穿孔。EP组术后腹腔注射EP溶液(40 mg/kg,间隔6 h),对照组、假手术组和ALI组腹腔注射等量乳酸林格液(间隔6 h)。模型复制24 h后心脏采血处死大鼠。酶联免疫吸附试验检测肺组织匀浆中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Toll样受体4(TLR4)及核因子κB(NF-κB)的表达;计算肺组织湿干重比;HE染色后光镜下观察肺组织病理结构变化。结果ALI组、EP组HMGB1、TLR4及NF-κB水平高于假手术组(P<0.05),且EP组低于脓毒症ALI组(P<0.05);对照组与假手术组HMGB1、TLR4及NF-κB水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。ALI组、EP组肺组织湿干重比高于假手术组(P<0.05),且EP组低于ALI组(P<0.05);对照组与假手术组肺组织湿干重比比较,差异无统计学意义(P>0.05)。对照组和假手术组肺组织结构完整,肺泡间隔无水肿、炎症;ALI组肺泡结构破坏严重,肺泡间隔增宽,肺间质明显渗出、出血和大量炎症细胞浸润;EP组肺泡结构较完整,与ALI组相比,肺间质渗出、出血及炎症细胞浸润症状明显减轻。结论EP可能通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路,减轻肺组织炎症反应,改善肺损伤程度从而对脓毒症ALI发挥保护作用。