肝癌细胞株-乙型肝炎病毒DNA整合事件的高通量靶向捕获测序分析

目的 采用探针捕获和高通量测序技术研究HepG2.2.15与HepAD38 2个乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)肝癌细胞系中病毒DNA在宿主基因组中的整合位点特征。方法 提取HepG2.2.15与HepAD38细胞基因组DNA,采用探针捕获和高通量测序策略对2个肝癌细胞株中整合的HBV DNA进行捕获测序,使用Trimmomatic、BBAP、BWA(Burrows-Wheeler Aligner)等生物信息学软件进行数据分析;最后通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)及克隆测序对病毒DNA整合特征进行验证。结果 利用探针捕获和高通量测序技术分别在HepG2.2.15与HepAD38细胞系中检测出12、7个HBV DNA整合事件,随机分布在chr1、chr2、chr7、chr9、chr16、chr17、chr19、chrX染色体上,整合位点上下游基因出现频率较高的有DPP7、TRIM56、GPC3等。结论 成功建立基于探针捕获和高通量测序技术检测HBV DNA在宿主基因组上的整合片段的方法,HepG2.2.15与HepAD38细胞系中HBV整合事件在染色体上随机发生,大部分整合位点发生在HBV基因组上的X基因区域。

基于多重长PCR靶向捕获测序技术的高同源SNP鉴定

为建立一种高同源区段的单核苷酸多态性(SNP)基因分型技术,通过构建本地Blast对SNP所在的200和400 bp区段进行同源性评估,并筛选出高同源区段的SNP。利用第一轮多重长PCR(polymerase chain reaction)捕获329个样本的9个高同源区段SNP所在的长片段,使用纯化后的第一轮PCR产物作为模板进行扩增子建库测序,检测样本共得2 928个SNP位点信息,测序成功率高达98.885 6%。利用Hardy-Weinberg(HWE)法则计算试验研究的9个高同源区段SNP位点的基因频率(p值均大于0.05,符合HWE法则),并与NCBI(national center for biotechnology information)中千人基因组数据库中获取的基因频率相比对,发现二者单碱基基因频率一致(误差限<0.15)。研究表明,利用多重长PCR靶向捕获技术结合二代测序技术为高同源区段的SNP分型提供一个准确、快速、大样本检测方案。

基于染色质免疫共沉淀的高通量测序数据集的顺式调控模体发现算法

针对新一代测序(NGS)的染色质免疫共沉淀的高通量测序(ChIP-Seq)数据集的模体发现问题,提出一种基于费舍尔(Fisher)精确检验的模体发现算法——Fisher Net。首先运用费舍尔精确检验计算所有k长短序的P值并筛选出模体的种子;然后,构建初始模体的位置赋权矩阵;最后,用位置赋权矩阵扫描所有k长短序形成最终模体。通过小鼠胚胎干细胞(m ESC)和红细胞、人类淋巴母细胞系的ChIP-Seq数据集以及ENCODE数据库的数据进行验证,结果表明所提算法精度和计算速度均高于其他常见的模体发现算法,并且能够发现超过80%的已知转录因子核心模体及其辅调控因子模体。该算法在保证高精度的同时可以应用到大规模测序数据集。

外显子捕获-高通量测序技术用于法洛四联症胎儿遗传学检测

目的用外显子捕获-高通量测序(exon-capture high-throughput sequencing,EC-HTS)技术寻找法洛四联症(tetralogy of fallot,TOF)胎儿可能存在的遗传学致病性证据,并探讨其在产前分子遗传学诊断中的价值。方法选择经超声心动图发现且G显带和微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization,a CGH)分析结果均正常的9例TOF胎儿作为研究对象,以63个人类已知的先天性心脏病致病基因作为检测靶点制作捕获芯片,用EC-HTS技术进行检测,数据经过Calling、数据库比对、软件分析得到最终病理性突变位点;并用Sanger测序对其进行验证。结果在9例胎儿中共检测到单核苷酸多态性(SNP)位点732个,结果经过生物信息学分析得到致病性突变位点3个:CITED2 c.574_579 del AGCGGC(p.S192_G193del纯合突变,CHD7c.2550_2554 del GAGAA(p.K850Nfs*6)杂合突变,NOTCH2 c.4918T>C(p.F1640L)杂合突变。Sanger测序结果验证了这3个突变位点的真实存在,父母溯源检测发现这3个点突变均为新发突变。结论用靶向性EC-HTS技术发现了3例TOF胎儿存在病理性基因突变,可能为其致病的遗传学病因。

靶向捕获高通量测序技术在检测早期乳腺癌胚系突变中的应用价值

目的应用靶向捕获高通量测序技术探究早期乳腺癌患者血浆胚系突变情况与临床病理特征的相关性。方法选取99例早期乳腺癌女性患者,采用靶向捕获高通量测序技术对其血浆标本进行21个乳腺癌易感基因测序,对检测到的突变位点进行筛选和分类,并分析其与临床病理特征的相关性。结果有48例患者检测出18个基因的55个突变位点,其中包含45个错义突变、1个无义突变、8个插入缺失突变、1个剪切位点突变。突变最多的为BRCA基因,检测出10个突变位点。55个突变位点中有9个(16.4%)为致病性突变,4个(7.3%)为无害突变,42个(76.3%)为意义未明突变;其中15个突变位点在ExAC、ClinVar、dbSNP、HGMD数据库中均未提及。统计分析结果显示,致病性胚系突变在不同年龄组和增殖细胞核抗原(Ki67)阳性与否的比较中,差异有统计学意义(P=0.044、0.024);>40岁和Ki67阳性患者发生致病性突变的概率更高。结论靶向捕获高通量测序技术应用于早期乳腺癌易感基因的筛查有一定意义,为临床个体化治疗提供了理论基础和实验依据。

高通量测序技术筛查单基因隐性遗传病

目的探讨用高通量测序技术筛查新生儿单基因隐性遗传病,评估其用于孕前筛查或产前诊断的可行性。方法用目标基因筛选和高通量测序分析法分别对非孕妇的血液基因组DNA和孕妇的血浆游离DNA样本进行400多种遗传病相关基因的全面筛查分析。结果用高通量测序技术成功地在非孕妇的血液中检测出相关的致病基因,并在疑似地中海贫血患者的基因组中发现了导致地中海贫血症的致病突变基因HBB（chr11：5246595 C/G）;成功地从孕妇血浆游离DNA检测出来自胎儿的遗传病相关致病基因突变,平均每个样本中有1～4个突变,基因型为杂合型。结论高通量测序技术可用于隐性基因携带者的孕前筛查及产前诊断。

高通量测序鉴定肥厚型心肌病患儿致病突变

目的利用目标基因靶向捕获高通量测序方法鉴定肥厚型心肌病(HCM)患儿的致病突变,分析基因型与临床表型的关系。方法对1例14岁男性HCM患儿进行血液与临床资料收集。提取其全血基因组DNA、文库制备,靶向富集8个编码肌小节蛋白的HCM的致病基因,并行高通量测序。通过生物信息学分析筛选致病突变。用1代测序来验证2代测序发现的致病突变位点。结果患儿有晕厥史,左心室严重肥厚,心电图呈传导阻滞。目标基因捕获高通量测序筛查致病突变的结果经与公共数据库和内部健康人测序数据库对比,发现致病突变位点MYH7R869C。此位点检测结果与Sanger测序结果完全一致。结论利用目标基因捕获测序技术可筛选出HCM致病突变MYH7 R869C。携带此突变的患儿临床表型严重。MYH7 R869C突变可能是我国HCM患儿的突变热点。

基于高通量测序技术的拷贝数变异筛选分析流程的建立及应用

目的基于高通量测序的CNVs分析流程(PICNIC)与常规拷贝数变异微阵列比较基因组杂交检测方法的检测效率和结果分析。方法纳入2016年1月1日至2017年12月31日复旦大学附属儿科医院分子诊断中心基于临床需要的、取得患儿家长知情同意的、同时送检了微阵列比较基因组杂交检测和高通量测序分析的病例。以微阵列比较基因组杂交为金标准,PICNIC为待测标准,微阵列比较基因组杂交检测采用安捷伦人类基因组CGH微阵列180K试剂盒,并经其软件进行数据处理和拷贝数变异检测。选择重复片段>500kb,缺失片段>200 kb的CNVs数据分析,经过筛选后,结合患儿表型人工进行结构评判,致病/可能致病(P/LP)为检测到的CNVs已知的表型与患儿表型相符合;临床意义未明(VUS)为检测到的CNVs已知的表型与患儿表型不完全相符合。PICNIC分析流程,从同一测序批次的BAM文件开始,经过外显子覆盖深度计算、质控筛选、CANOES计算CNVs评分并提供候选CNVs。后续从基因水平和区域水平二方面对CNVs进行注释和筛选。比较2种方法间检出率及其敏感性。结果 113例同时送检了微阵列比较基因组杂交检测和PICNIC测序分析流程,平均年龄2岁,发育迟缓82例,惊厥16例,孤独症5例,先天性心脏病3例,遗传咨询病例7例。微阵列比较基因组杂交检测到P/LP为76例,VUS为16例; PICNIC检测到P/LP为92例,VUS为21例;微阵列比较基因组杂交检测到的P/LP和VUS病例,均包含在PICNIC检测到的病例中,16例微阵列比较基因组杂交检测VUS结论的CNVs被PICNIC纳入P/LP,敏感度100%(95%CI:94%～100%),特异度100%(95%CI:81%～100%),阳性预测值82.6%(95%CI:73%～89),阴性预测值56.8%(95%CI:40%～72%)。微阵列比较基因组杂交检测到的446个CNVs中,PICNIC也检测到190个,在PICNIC到的236个CNVs中,微阵列比较基因组杂交检测也检测到190个。结论 PICNIC分析流程对于P/LP的CNVs,具有100%的特异性和敏感性,可用于CNVs的临床检测。该方法的建立及临床推广对于进一步挖掘高通量捕获测序数据具有重要意义。

复旦大学附属儿科医院高通量测序数据一体化全流程闭环分析系统及临床应用案例分析

背景目前的临床遗传诊断中,外显子组捕获测序(ES)和全基因组测序(WGS)均有广泛的应用场景且在综合性价比和变异检测范围等方面各有优势;建立支持两种不同建库策略测序方案的整合性遗传诊断流程,是进一步提高遗传诊断敏感性和检测效率的关键。目的整合ES以及WGS场景下的多变异类型分析、遗传病复杂临床表型的标准化与结构化、表型导向的遗传变异分析系统,建立从临床检测申请到遗传报告反馈的一体化流程。设计流程开发。方法(1)建立复旦大学附属儿科医院高通量测序数据一体化全流程闭环分析系统(复旦流程3.0)各个模块:①病史处理,②结构化遗传表型,③测序实验,④变异检测,⑤变异解读,⑥质控复核,⑦基因型表型联合分析。(2)代表性病例重测分析:根据结论性变异的类型和诊断难度选择代表性病例,展示代表性病例从病史处理开始到报告草稿为止各模块的运行情况。主要结局指标代表性病例分析过程中的结构化表型、数据质控、变异检测及解读、最终诊断。结果对3例代表性病例的重分析中,分别进行了经济版家系WGS、先证者WGS以及ES;病史成功提取结构化表型;FastQ及BAM文件结果数据质控良好;检测到的变异经解读之后进行基因型表型联合分析,分别检测出3例病例的复杂遗传模式。例1:ANTXR2基因点突变NM_058172:c.1294C>T与4q21.22约13 kb的结构变异缺失形成隐性纯合致病;例2:线粒体MT-ND6基因致病变异m.14459G>A,异质性>99.5%;例3:SMN1基因纯合致病变异NM_000344:c.863G>T合并SMN1基因单拷贝缺失。结论复旦流程3.0可整合ES和WGS数据,处理不同类型的变异结果,最终形成遗传诊断,且对复杂变异类型有高效处理能力。

目标基因捕获测序技术检测1例肥厚型心肌病致病基因突变

目的通过靶向捕获高通量测序技术初步筛查肥厚型心肌病(HCM)致病基因突变。方法收集1例HCM患者临床信息和外周血,并提取基因组DNA,制备DNA全基因组文库。挑选导致HCM的8个候选基因,用GenCap基因序列捕获技术靶向富集该患者外周血DNA候选基因并行高通量测序。通过生物信息学分析筛选致病突变。用Sanger测序来验证相应致病基因突变位点。结果目标基因靶向捕获测序结果经与公共数据库和内部健康人测序数据库对比,发现致病基因突变位点MYBPC3 D770N,该致病基因突变与Sanger测序结果一致。结论用目标基因靶向捕获测序技术可实现对HCM致病基因突变的初步筛查,对HCM的临床基因诊断具有潜在的应用价值。

目标基因捕获测序技术鉴定肥厚型心肌病致病突变的研究

目的:利用目标基因靶向捕获高通量测序方法鉴定肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)致病突变,并进行基因型-临床表型的分析,以期对临床诊治提供参考依据。方法:连续收集10例HCM患者血液与临床资料。提取全血基因组DNA、文库制备,靶向富集8个编码肌小节蛋白的HCM的致病基因,并行高通量测序。结果:10例患者[平均年龄为(46±7.9)岁,女性占50%]中,4例患者发现5个基因突变位点。双突变(TNNT2 R286H和MYH7 R663H)携带者具有HCM家族史,发病早,左心室重度肥厚,心电图呈现传导阻滞。MYBPC3 D770N和MYBPC3 S236G突变携带者发病年龄晚,左心室肥厚程度较轻。MYH7 R869C突变携带者年龄大,左心室肥厚程度较重,心电图呈现明显左心室肥大证据。结论:对10例HCM患者利用目标基因捕获测序技术筛选出5个致病突变。携带不同突变的患者其临床表型不一致,这对患者的预后和治疗提供了有利的依据。

目标基因捕获测序技术检测肺动脉高压致病基因突变的研究

目的:利用目标基因捕获测序技术,对9例肺动脉高压(PAH)患者进行4个已知致病基因突变筛查,探讨利用目标基因捕获测序技术对PAH进行基因诊断的可行性。方法:抽取PAH患者外周血,提取全基因组DNA,制备文库。设计骨形成蛋白2型受体(BMPR2)、激活素受体样激酶1(ACVR1)、细胞内皮糖蛋白(En G),信号蛋白SMAD4基因(SMAD4)外显子区域特异性捕获探计,利用目标基因捕获技术,进行杂交,富集目标基因组区域的DNA片段,利用Illumina Hi Seq 2000进行高通量测序,分析致病基因突变与PAH的相关性。结果:9例患者中,2例患者发现BMPR2基因突变,1例发现ACVRL1突变,BMPR2突变临床症状较重,ACVRL1突变发病年龄较小。结论:本研究利用目标基因捕获测序技术,在9例PAH患者中查出3个致病基因突变。该方法快速有效,可实现对PAH致病基因突变的初步筛查,对PAH的临床基因诊断具有重要价值。

外显子捕获测序技术用于室间隔缺损胎儿遗传学病因检测

目的:探讨外显子捕获-高通量测序技术检测室间隔缺损(VSD)胎儿遗传学病因的可行性。方法:选择超声心动图诊断为VSD且微阵列比较基因组杂交(a CGH)和G显带检测结果均正常的19例胎儿作为研究对象;将已知的63个人类先心病致病基因作为检测靶点制作成捕获芯片,对各个样本DNA进行外显子捕获后高通量测序,数据经过滤、数据库比对、生物学软件分析得到最终病理性突变位点;病理性突变位点用Sanger测序验证。结果:19例VSD胎儿中共检测到1540个基因突变位点,数据库比对、生物信息学分析后得到8个病理性突变位点:JAG1 c.1078T>G(p.C360G),CHD7 c.6718G>T(p.D2240Y),NOTCH2c.6131G>A(p.R2044H),MYH7 c.77C>T(p.A26V),ZFPM2 c.2107A>C(p.M703L),CHD7 c.7198C>T(p.R2400W),HAND2 c.341G>A(p.S114N),MLL2 c.12140_12168del GGCCGTTAGCAATAGGAACTACCCCTGAG(p.G4047Vfs*5),其中MYH7、ZFPM2两个突变点为已报道突变,其余6例未见报道。8个突变位点的Sanger测序结果与高通量测序结果一致。父母溯源分析均为新发突变。结论:外显子捕获芯片用于VSD胎儿遗传学检测可提高阳性检出率,具有较好的临床应用价值。

染色质空间构象和IncRNAs功能的关系

新一代测序技术的广泛应用使得人们对哺乳动物的转录组有了深入的认识,作为基因组转录的主体,非编码RNA的功能研究成为当今生命科学界新兴的研究热点。目前发现越来越多的长链非编码RNAs（long noncoding RNAs,lncRNAs）发挥着重要的调控功能,然而,相对于数以万计的lncRNAs转录本来说这还只是很小的一部分。

核小体及染色质修饰的基因组分布模式和染色质状态

染色质是真核DNA的存在方式,可以通过影响DNA的可及性调节基因转录,其基本单元为核小体,系由约147 bp的DNA缠绕在组蛋白八联体上形成的结构,核小体之间以连接DNA相连.核小体组蛋白上能发生甲基化和乙酰化等化学修饰.核小体位置、DNA的甲基化和组蛋白的修饰等对染色质状态(常染色质或异染色质)及基因组之间的长程相互作用有重要影响.近年,基于高通量测序技术,核小体位置和染色质修饰在多种细胞中的基因组分布已被测定.结果显示,这些标记的分布模式具有位点特异、动态变化、相互偶联和高度复杂的特征.本文详细回顾并评述了核小体位置和染色质修饰的分布模式、对应生物学功能、修饰之间的关联、实验测定技术、染色质状态的计算分析等内容.该工作对于深入认识和理解染色质的表观遗传调节机制有重要意义.

1007例新生儿听力筛查及耳聋基因测序结果分析

目的研究南宁市新生儿耳聋基因突变情况,评估新生儿听力筛查准确性,探讨突变位点与听力损失的关系。方法采用耳声发射和自动听性脑干诱发电位反应对出生于2016年1月-2018年12月的17000例新生儿进行听力初筛、复筛及确诊检查,针对GJB2、GJB3、SLC26A4基因对1007例听力初筛未通过的新生儿进行靶向捕获高通量测序,结合生物信息学分析,明确突变位点致病性。结果1007例初筛未过的新生儿中,确诊听力损失78例,355例(35.25%,355/1007)检出突变耳聋基因,其中237例检出12种“致病的”或“可能致病的”突变位点,78例检出新错义突变位点(GJB2:c.217C>A、c.316T>G、c.676G>T;SLC26A4:c.739T>C),13例听力确诊正常者检出11种非编码区突变。GJB2、GJB3、SLC26A4基因的突变携带率分别为1.75%、0.66%、0.36%。GJB2:c.79G>A和GJB3:c.357C>T、c.341A>G、c.608T>C的等位基因频率符合哈迪-温伯格遗传平衡定律,GJB2:c.79G>A(Z=3.082;P<0.01)、c.109G>A(Z=10.670;P<O.O1)和GJB3:c.357C>T(Z=2.902;P<0.01)、c.341A>G(Z=2.798;P<0.001)与听力损失的关联具有统计学意义。结论本研究证实GJB2 c.109G>A是南宁市新生儿携带率最高的耳聋基因突变位点。结合听力和基因检测是临床早期干预非综合征型听力损失更有效的策略。

植物三维染色质构型研究进展

染色质在细胞核内的缠绕、折叠及其在细胞核内的空间排布是真核生物染色质构型的主要特征。在经典DNA探针荧光原位杂交显微观察的基础上,基于新一代测序技术的Hi-C及ChIA-PET染色质构型捕获技术已经被广泛应用于动物及植物细胞核染色质构型的研究中,并以新的角度定义了包括:染色体(质)域(chromosome territory)、A/B染色质区室(compartment A/B)、拓扑偶联结构域(topological associated domains,TADs)、染色质环(chromatin loops)等在内的多个更为精细的染色质构型。利用以上两种主流技术,越来越多的植物物种染色质构型特征被鉴定、分析和比较。本文系统分析和总结了近年来以植物细胞为模型的细胞核染色构型领域取得的重要成果,包括各级染色质构型特征的组成、建立机制和主要影响因素等。在此基础上,分析了目前研究植物染色质构型技术的瓶颈和突破性的技术进展,并对后续研究主要关注的问题和研究内容进行了展望,以期为相关领域的研究提供更多的理论参考和依据。

全基因组染色质相互作用Hi-C文库制备的优化及其质量控制

Hi-C(highest-throughput chromosome conformation capture)技术是近年出现的一种研究染色质相互作用的关键技术。该技术步骤多、耗时长,涉及的试剂耗材繁杂,目前常规流程还有较多可以改进优化的步骤。本研究以GM12878细胞为材料,通过优化常规Hi-C实验中的交联、酶切、限制性内切酶的失活、末端生物素标记、原位连接等关键步骤,建立了稳健的Hi-C流程,制备了相应的Hi-C文库。文库经初步的Sanger测序等质量控制以后,两个生物学重复文库进行了高通量测序。测序结果利用生物信息学处理发现:原始测序数据中可比对率和配对率分别达到90%和72%左右。此外,去除自连片段(self-circular ligation)和dangling-ends片段以后,可获得超过96%的有效相互作用对,其中染色体内相互作用数据达到60%。进一步的染色体相互作用热图分析可见清晰拓扑学相关结构域TADs(topologically associated domains),与已发表的文献报道一致。而两次生物学重复之间的相关性分析则表明bin coverage和all bin pairs的相关性都极强。上述结果表明通过对常规Hi-C流程关键步骤的优化,本研究建立了高效、稳健、可靠的Hi-C流程,对Hi-C技术的进一步使用与推广具有重要的参考价值。

基于染色质交互数据的基因组组装方法

伴随着高通量DNA测序技术的不断推陈出新和价格持续下调,如何将scaffolds定位于染色体逐渐成为完整参考基因组获得的关键。高通量染色质构象捕获技术(High-throughput chromosome conformation capture,简称Hi-C)的出现为基因组组装过程中scaffolds快速锚位提供了契机。相比于传统的基因组组装方法,基于染色质交互组装基因组的策略实验操作简易、实验和时间成本较低、正确率及分辨率高,在基因组相对复杂的多倍型和高度杂合的物种中有着更大的应用前景。但由于技术本身的限制,该方法还存在分辨率、背景噪声等问题需要解决,有待进一步改进和提高。

染色质开放状态对结肠癌相关功能通路影响的生物信息学分析

目的利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库的染色质开放性高通量测序(ATAC-seq)数据和转录组测序(RNA-seq)数据,探索染色质开放状态对结肠癌相关功能通路的影响。方法从TCGA数据库下载结肠癌ATAC-seq数据和RNA-seq数据,使用R 3.5.3软件对ATAC-seq数据进行质量控制。对全部样本ATAC-seq数据峰值(peaks)进行基因注释,对所注释基因进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。选择结肠癌关键基因肿瘤抑制基因APC(APC)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、v-raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF),对3个基因的启动子区ATAC-seq数据peaks与RNA-seq的每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数(FPKM)进行Pearson相关性分析。对TNM分期Ⅲ+Ⅳ期和Ⅰ+Ⅱ期的组织样本进行差异ATAC-seq数据peaks分析,并对上调和下调peaks注释基因进行KEGG通路富集分析。结果结肠癌ATAC-seq数据peaks在染色体分布均匀,大多数分布于启动子区(距离转录起始位点≤1 kb、>1~2 kb、>2~3 kb者分别占30.17%、5.42%、3.88%)和远端基因间区(26.17%),符合染色质开放区2种主要类型的分布。GO功能和KEGG通路富集分析结果显示,结肠癌ATAC-seq数据peaks注释基因显著富集于癌症相关功能和通路,如Wnt信号通路的细胞间信号转导、表皮生长因子受体(ErbB)信号通路等。结肠癌关键基因APC、KRAS、BRAF启动子区ATAC-seq数据peaks与其RNA-seq的FPKM呈正相关。TNM分期Ⅲ+Ⅳ期相对Ⅰ+Ⅱ期患者上调peaks注释基因显著富集于ErbB信号通路、Wnt信号通路、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路等增殖、侵袭和转移相关信号通路,下调peaks注释基因显著富集于T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、细胞黏附分子信号通路等免疫识别相关信号通路。结论染色质开放状态对结肠癌相关功能通路调控起着重要作用。