基于mRNA高通量测序初探雷帕霉素联合鞭毛蛋白体外抑制4T1乳腺癌细胞的机制

目的:利用mRNA高通量测序初步探讨雷帕霉素(Rapa)联合鞭毛蛋白(FliC)体外抑制4T1乳腺癌细胞的机制。方法:将4T1乳腺癌细胞分为对照(control)组、Rapa组、FliC组、Rapa+FliC组等4组,CCK-8法与流式细胞术检测细胞活力、凋亡的变化情况。同时,通过mRNA高通量测序,对差异表达基因(DEGs)进行KEGG通路分析;此外,通过STRING分析Rapa+FliC组与Rapa组两组间的DEGs,构建DEGs的蛋白相互作用(PPI)网络、筛选Hub基因。结果:CCK-8和流式细胞术检测结果显示,Rapa+FliC对4T1乳腺癌细胞的活力抑制率和凋亡率都显著高于Rapa和FliC(P<0.05)。转录组测序结果显示,Rapa组和control组之间共有579个DEGs,主要富集于PI3K/Akt等信号通路;FliC组和control组之间的DEGs主要富集于Nod样受体等信号通路;Rapa+FliC组与Rapa组之间共有150个DEGs,主要富集于mTOR等信号通路。从PPI网络中,成功筛选出Atm、Itga2等10个Hub基因。结论:Rapa+FliC可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路,在体外抑制4T1乳腺癌细胞活力,促进细胞凋亡;Atm和Itga2基因可能是两者联合作用的关键基因。

中国中部地区乳腺癌遗传易感基因BRCA1/2高通量测序情况分析

目的:分析中国中部女性遗传性乳腺癌患者BRCA1/2基因遗传变异情况,探究中国人群乳腺癌易感基因BRCA1/2的遗传变异热点,为临床乳腺癌风险评估提出可靠依据。方法:对乳甲外科收治的具有乳腺癌家族史的女性患者62例,无家族史正常女性志愿者60例,利用Life Tech Ion Proton高通量测序技术对BRCA1/2基因进行测序分析,并用sanger测序法验证。结果:在62例有家族史乳腺癌患者中,BRCA1基因突变率为25.8%(16/62),BRCA2基因突变率为33.9%(21/62),BRCA1/2有害变异率为11.3%(7/62)。乳腺癌家族史患者组与正常组对比分析,家族史乳腺癌患者组BRCA1/2基因变异率(45.2%)显著高于正常对照组(31.7%)。通过家系分析和数据比对发现BRCA1c.4986+1G>T和BRCA2 5773C>T为中国人群遗传性乳腺癌有害变异。结论:家族遗传性乳腺癌患者BRCA1/2基因变异率显著高于正常人群。通过家系遗传分析并利用高通量测序技术可以有效地筛选出乳腺癌BRCA1/2基因的有害变异,为乳腺癌的风险评估提供可靠的临床依据。

基于高通量测序分析鉴别视网膜病变中的神经纤维瘤病

目的:通过高通量测序分析进行基因诊断,鉴别视网膜病变中的神经纤维瘤病,为其早诊早治提供重要依据。方法:回顾性分析眼遗传病高通量测序数据库中的NF1和NF2基因变异,根据ACMG/AMP指南解析变异致病性;进一步结合患者的临床表型、家族史以及其他检查结果,综合判断明确是否患有神经纤维瘤病,同时进行疾病的进展和随访的研究分析。结果:通过分析不同眼部表型家系的高通量测序结果,共在11例先证者中发现NF1和NF2基因的10个可能致病变异,包括7个NF1变异和3个NF2变异。这11例先证者的初始诊断包括家族性渗出性玻璃体视网膜病变、黄斑/视网膜发育不良、斜视、视网膜色素变性、Coats病和牵牛花综合征等。其中,在1例初诊为家族性渗出性玻璃体视网膜病变的患儿中,检测到3个基因的致病变异,即NF2:c.122G>A/p.(W41*)、RS1:c.520C>T/p.(R174W)和NYX:c.1027C>T/p.(R343C)。随访检查发现,该患儿的复杂眼部表型符合NF2、RS1和NYX致病变异的临床改变,且MRI检查发现双侧前庭神经鞘瘤、脊髓室管膜瘤和多发性神经鞘瘤改变。除该患者外,还有4例患者在随访中发现存在牛奶咖啡斑或雀斑样色素沉着等皮肤改变,1例合并小脑神经纤维瘤浸润。结论:高通量测序分析能有效检测出神经纤维瘤病相关基因的变异,有助于筛选非典型表现的神经纤维瘤病,为疾病的早期诊断,尤其是对严重中枢神经系统病变的早期筛查和及时干预,提供了重要依据。

应用高通量测序方法研究CRF01-AE亚型HIV-1毒株耐药突变的分子进化规律

目的探讨CRF01-AE亚型人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)毒株在药物选择压力下耐药突变发生和演变的规律。方法选取5例一线方案治疗失败的CRF01-AE亚型HIV-1患者,收集其6~8年抗病毒治疗过程中的系列血样,应用高通量测序方法进行基因型耐药突变分析。结果①5例患者在启动治疗后早期即出现M184V突变以及非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)类耐药突变,常见的有K101E、G190A和K103N,其中M184V+G190A+TAMs是常见突变组合,停药或更换二线药物,这些突变也始终存在。②胸腺嘧啶脱氧核苷类似物变异(TAMs)突变形成过程中,有3例患者表现为TAM2路径,1例患者为TAM1途径,还有1例患者前期只有TAM2路径的突变,后期累加上TAM1途径的突变。③有3例患者在治疗过程中分别形成TAMs、Q151M复合体和T69插入复合物等多重耐药突变,更换二线方案后仍然治疗失败。结论①CRF01-AE亚型耐药患者在用药早期即开始出现耐药突变,数种突变逐渐累加,最终导致临床耐药,应尽早进行耐药突变监测。②TAMs突变通过2种途径竞争性发展,CRF01-AE亚型更偏向于TAM2途径,但随着治疗时间延长,2种途径可以产生融合。③更换二线方案前应排查针对替诺福韦(TDF)的耐药突变,其可能会导致二线方案无效。

应用高通量测序研究人参皂苷Rh1对乳腺癌SKBR3细胞基因表达的影响

目的观察人参皂苷Rh1对乳腺癌SKBR3细胞基因表达的影响,筛查人参皂苷Rh1干预下乳腺癌SKBR3细胞中差异表达的基因。方法对乳腺癌SKBR3细胞进行样本准备,获得去rRNA链特异性转录组;测序获得原始图像文件经碱基识别后转化为原始序列文件;通过质量分析评估测序数据是否适合进行生物信息学分析,应用剪切转录产物比对软件(STAR)对测序数据与参考基因组进行比对;基于美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库,对人参皂苷Rh1干预下乳腺癌SKBR3细胞基因的表达及差异基因的表达进行分析。结果高通量测序共筛查出基因26978个,其中根据NCBI数据库注释为m RNA的基因19229个,注释为lncRNA的基因4385个,高通量测序结果表明差异表达基因6580个,以Fold change>1为上调,<-1为下调,上调差异基因3403个,其中差异表达显著基因为小整合膜蛋白11A(SMIM11A)、嘌呤能受体P2X1(P2RX1)、碳酸酐酶9(CA9)、磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基δ核糖核酸2(PIK3CD-AS2)、血管活性肠肽受体2(VIPR2)、非特征LOC100506314(LOC100506314)、长基因间非蛋白编码核糖核酸1389(LINC01389)、表皮生长因子受体激酶底物8-样蛋白3(EPS8L3)、视网膜筋膜基因2(FSCN2)、肠壁碱性磷酸酶(ALPI);下调差异表达基因3177个,其中差异表达显著基因为溶质载体家族1成员3(SLC1A3)、羟基类固醇17-β脱氢酶1(HSD17B1)、碳水化合物磺基转移酶11(CHST11)、溶质载体家族25成员51(SLC25A51)、β-1,3-半乳糖基转移酶6(B3GALT6)、非特征LOC101929882(LOC101929882)、δ连环蛋白家族成员(ARVCF)、蛋白磷酸酶2A催化亚基α(PPP2CA)、星形胶质细胞上调基因-1(AEG1)、磷脂酰肌醇-4-激酶B(PI4KB)。结论应用高通量测序技术可筛查出人参皂苷Rh1对乳腺癌SKBR3细胞增殖相关的差异性表达基因,并对筛选出的重要基因进行总结和分类。

高通量测序分析高血压伴或不伴牙周炎大鼠牙龈mRNA差异

目的基于高通量测序(next generation sequencing,NGS)技术分析高血压大鼠伴或不伴牙周炎状态下牙龈组织中的差异mRNA,旨在为高血压伴牙周炎的防治提供实验基础。方法获得动物实验伦理委员会批准,通过给予含8%(w/w)NaCl的高盐饲料建立高血压大鼠模型,使用3-0的无菌丝线结扎大鼠下颌第一磨牙建立牙周炎大鼠模型,分为正常对照组(N组)、高血压组(H组)和高血压伴牙周炎组(PH组),测量血压、心率、牙槽骨吸收量和牙槽骨中破骨细胞数量;取3组牙龈组织进行NGS,分析组间差异基因表达;H组和PH组间所有差异基因行基因功能(gene ontology,GO)富集分析,行京都基因与基因百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,行蛋白相互作用网络(protein-protein interaction,PPI)筛选关键基因;免疫组织化学验证关键通路中的关键基因在各组的表达,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析关键基因在各组全身循环中的表达。结果实验终点(第11周)时,H组和PH组的血压均高于N组(P<0.001),但PH组的血压与H组比较无统计学意义,3组心率无统计学差异。Micro-CT显示PH组下颌第一磨牙的釉牙骨质界(cemento-enamel junction,CEJ)到牙槽骨嵴顶(alveolar bone crest,ABC)距离较N组和H组增加,牙槽骨中破骨细胞数量多于N组和H组(均P<0.0167)。3组的共同差异基因为0个,H组和PH组牙龈组织共235个差异基因,相较于H组,在PH组有P-选择素(P-selectin,SELP)、角蛋白16(keratin 16,KRT16)和S100钙结合蛋白A9(S100 calcium binding protein A9,S100A9)等137个上调基因,以及FK506结合蛋白5(FK506 binding protein 5,FKBP5)、介体复合体亚基22(mediator complex subunit 22,MED22)和含锌指和BTB域16(zinc finger and BTB domain containing 16,ZBTB16)等98个下调基因。H组和PH组差异基因的GO分析结果提示,主要富集的生物学过程(biological processes,BP)为白细胞迁移,主要的细胞成分(cellular component,CC)为胶原三聚体复合物,主要的分子功能(molecular functions,MF)为细胞外基质结构的构建;H组和PH组差异基因的KEGG信号通路主要富集于细胞因子之间受体相互作用、白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)信号通路中。通过PPI分析筛选出4个作用于高血压状态下牙周炎的关键基因,包括白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、Ⅰ型胶原α1(collagen type I alpha 1,COL1α1)、趋化因子配体1(chemokine ligand 1,CXCL1)。与N组和H组比较,IL-1β和TNF-α在PH组牙龈组织及全身血清中的表达均上调(P<0.0167)。结论高血压伴牙周炎或不伴牙周炎时的差异mRNA为IL-1β和MMP-9以及差异信号通路为IL-17和TNF-α信号通路,为今后进一步研究高血压伴牙周炎的分子调控机制提供了实验基础。

基于16S rRNA高通量测序技术探究补中益气加减方对胃癌荷瘤小鼠肠道菌群的影响

目的:基于16S rRNA高通量测序技术观察补中益气加减方对胃癌荷瘤小鼠肠道菌群结构组成和多样性的影响,探讨该中药复方治疗胃癌的潜在作用机制。方法:取24只小鼠采用腋下皮下注射MKN-28人胃癌高转移细胞悬液的方法制作胃癌荷瘤小鼠模型,待瘤块长到5 mm^(3)时视为造模成功。将造模成功的小鼠随机分为模型组、补中益气加减方组(中药组)和程序性死亡受体1(PD-1)抗体组(阳性药物组),每组8只,另取8只正常小鼠作为正常组。中药组按每日25 g/kg剂量灌胃给药,连续灌胃24 d;阳性药物组按每次10 mg/kg,每3 d腹腔注射1次给药,共给药8次;正常组和模型组给予每日1次等体积生理盐水灌胃,连续24 d。给药期间监测各组小鼠体质量,给药结束后收集小鼠粪便颗粒,运用16S rRNA高通量测序技术检测小鼠粪便中的肠道菌群结构组成和多样性,随后分离肿瘤并称重。结果:给药期间各组小鼠体质量波动不大,给药结束后各组小鼠体质量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。给药结束后,中药组和阳性药物组小鼠瘤质量均显著低于模型组(P<0.05,P<0.01)。各组小鼠肠道菌群的操作分类单元(OTUs)共有17 905个,每组特异性OTUs分布为正常组1309个,模型组6236个,中药组1110个,阳性药物组462个。α多样性方面,模型组小鼠肠道菌群丰富度指数和多样性指数均显著升高(P<0.01,P<0.05),而中药组、阳性药物组小鼠肠道菌群上述指数均较模型组显著降低(P<0.01);β多样性方面,模型组和正常组小鼠的肠道菌群微生物群落构成差异明显,而中药组和阳性药物组与正常组接近。在门水平方面,与正常组比较,模型组小鼠肠道菌群中拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度降低,厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)丰度升高,差异均无统计学意义(P>0.05);Firmicutes/Bacteroidetes值(F/B值)显著升高(P<0.01)。与模型组比较,中药组和阳性药物组小鼠肠道菌群中Bacteroidetes、Proteobacteria丰度升高,Firmicutes丰度降低,差异均无统计学意义(P>0.05);F/B值显著降低(P<0.05,P<0.01)。在属水平方面,与模型组比较,中药和阳性药物可共同调节胃癌荷瘤小鼠肠道菌群Muribaculum、Enterorhabdus、Anaerostipes、Barnesiella、Clostridium、Lacrimispora、Lactonifactor、Dorea、Streptococcus、Mediterraneibacter10个菌属(P<0.05)。结论:补中益气加减方对胃癌荷瘤小鼠瘤体有抑制作用。胃癌造模使小鼠肠道菌群结构发生变化,补中益气加减方与PD-1抗体均能有效改善胃癌荷瘤小鼠肠道菌群多样性,维护肠道微生态平衡,这可能是两种药物抑制胃癌进展的共同靶点。

高通量基因测序确诊PKD1基因新移码突变致常染色体显性遗传性多囊肾

目的验证1例常染色体显性遗传性多囊肾患者的致病基因并进行家系分析。方法收集患者及其女的外周血,采用Long-PCR和新一代高通量测序技术对常染色体显性多囊肾基因进行检测,并用Sanger测序进行验证。结果发现患者携带PKD1基因c.10396_10397delTC(Ala3467Ilefs*3)杂合移码变异,该变异导致蛋白质截短表达并影响其功能,其女携带相同突变基因。结论 PCR联合Sanger序列分析证实PDK1基因 c.10396_10397delTC(Ala3467Ilefs*3)变异为致病变异,该变异目前少有报道,丰富了PKD1的基因突变谱。

结节性硬化症TSC1/TSC2基因突变的高通量测序快速诊断

目的建立结节性硬化症TSC1/TSC2基因高通量测序技术以快速准确检测结节性硬化的TSC基因突变。方法对10例结节性硬化症患者及10例正常对照进行研究,利用长链PCR方法扩增TSC1及TSC2基因所有外显子区域,运用Ion PGMTM平台进行二代测序并运用常规测序验证。结果设计引物对TSC1及TSC2基因特异性扩增出7个长片段产物,产物长度介于13 kb^15 kb间;运用二代测序技术快速鉴定出10个致病突变,其中,7个突变位于TSC2基因,3个突变位于TSC1基因;所有突变经常规Sanger测序验证,结果一致。结论高通量二代测序技术可快速可靠诊断结节性硬化症TSC1、TSC2基因突变。

人参皂苷Rb1干预DSS诱导结肠炎模型小鼠转录组高通量测序及分析

目的研究人参皂苷Rb1干预葡聚糖硫酸钠盐(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)诱导结肠炎模型小鼠转录组学信息特征。方法C57BL/6雄性小鼠构建动物模型,将15只小鼠分为正常组、模型组和Rb1组,每组5只。模型组和Rb1组给予4%DSS并自由饮水,第2天给Rb1组40 mg/kg Rb1进行干预。持续9 d,处死小鼠后,取结肠组织。利用Illumina高通量测序平台分别对三组小鼠结肠组织进行转录组测序。利用测定的转录组学数据对Rb1组和模型组两两比较之后进行重叠分析,筛选差异基因进行GO和KEGG分析。结果Rb1干预后各项指标均有改善;GO富集后其有10450个有效差异表达基因得到GO注释,其中分子功能占13.5%,生物过程占68.73%,细胞组成占17.77%;富集最显著的前20个KEGG通路中与Rb1干预后密切相关的有钙离子信号通路、神经活动配体-受体相互作用通路以及c AMP信号通路。结论人参皂苷Rb1能够缓解DSS诱导结肠炎模型小鼠的症状。通过构建Rb1干预后DSS诱导结肠炎模型小鼠结肠组织转录组序列数据库,为以后Rb1功能基因的挖掘和参与代谢途径提供数据支撑,为临床应用提供新的思路。

基于高通量基因测序分析腐乳微生物多样性

研究腐乳生产过程中环境微生物对其品质及风味的影响。选择自然发酵腐乳和纯种发酵腐乳,通过高通量基因测序技术鉴定腐乳中微生物的多样性和丰度,其中细菌采用16S rDNA测序,真菌采用ITS1测序。结果表明,在细菌门水平上,变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是4个腐乳样品的主要菌门。真菌门水平主要是子囊菌门(Ascomycota)、unclassified_k__Fungi、担子菌门(Basidiomycota)和毛霉亚门(Mucoromycota)。在细菌种水平上,草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)在A、B、C、D 4种样品中相对丰度都很高,分别为2.30%、20.95%、12.51%、48.75%,且在自然发酵腐乳中的含量高于纯种发酵腐乳。真菌主要菌种是酵母菌,样品A主要包括unclassified_k__Fungi(63.20%)和粉状米勒酵母(Millerozyma farinosa)(25.80%)。在B、C、D三个样品中以Debaryomyces prosopidis为主,相对丰度分别为37.60%、51.70%、85.90%。

靶向高通量测序检测卵巢癌患者易感基因突变与临床特征的相关性研究

目的探讨卵巢癌易感基因突变与临床特征的关系。方法采用靶向高通量测序技术对35例卵巢癌患者的外周血进行BRCA1,BRCA2,CHEK2,PALB2,BRIP1,TP53,PTEN,STK11,CDH1,ATM,BARD1,MLH1,MRE11A,MSH2,MSH6,MUTYH,NBN,PMS1,PMS2,RAD50和RAD51C共21种易感基因进行测序,结合临床资料分析基因突变与卵巢癌的相关性。结果卵巢癌患者多以高级别浆液性卵巢癌晚期为主。35例卵巢癌患者中共检出已知致病突变19例,突变率54.3%,其中BRCA1基因突变7例(20.0%),BRCA2基因突变4例(11.4%),RAD51C基因突变2例(5.7%),CHEK2,ATM,RAD50,MSH2,MRE11A和TP53基因突变各1例。BRCA1/2基因突变和高级别浆液性卵巢癌相关(P=0.034),和家族史显著相关(P=0.003),与年龄、FIGO分期无显著相关性(P>0.05)。另外,发现两种新的基因突变,包括BRCA1基因c.438delC和RAD51C基因c.390_391delAA。结论BRCA1和BRCA2是卵巢癌最主要的胚系突变基因,该基因突变与遗传性卵巢癌显著相关。高通量基因测序技术可有效检测卵巢癌胚系易感基因的突变情况,为卵巢癌的早期诊断和预防提供科学依据。

基因测序技术的研发现状及其在医药领域的应用

自第1代测序技术发现以来,基因测序技术发生了快速更迭,经历了高通量测序技术、单分子实时测序技术、纳米孔测序技术的发展变革,并不断推动着医药领域的发展。本文将系统综述基因测序技术的发展历程,总结各类技术特点、优势、劣势及代表性企业,介绍各类技术在医药领域应用场景,为基因测序技术未来发展提供重要参考。

目的基因捕获结合二代测序技术诊断遗传性大疱性表皮松解症及COL7A1基因新突变分析

目的:应用目的基因捕获技术诊断遗传性大疱性表皮松解症,探讨其价值及发现致病突变。方法:收集复旦大学附属儿科医院皮肤科临床诊断为遗传性大疱性表皮松解症的患儿临床资料。提取患儿及其父母外周血DNA,采用目的基因捕获结合二代测序技术,并与人类参考基因组hg19进行比对。Sanger测序进行位点及突变来源验证。1000genomes数据库查询变异频率,对于新发变异应用软件预测序列保守性和致病意义。PhastCons软件在物种间比对核苷酸序列保守性,取值范围0～1,接近1提示高度保守。MutationTaster2软件预测突变致病意义。结果:患儿出生后左侧小腿伸侧至足背皮肤缺损。测序发现与临床表型符合的靶基因COL7A1的2个变异位点,c.6900+2T>G和c.8819-3C>T,Sanger测序验证存在上述变异,先证者父亲在2个位点均未发生变异,母亲存在c.8819-3C>T变异。其中c.6900+2T>G为新发突变,位于经典的前体m RNA剪接区。c.8819-3C>T在正常人群频率0.04%,为低频突变位点。PhastCons软件计算c.6900+2T序列保守性得分为1,提示高度保守性序列,c.8819-3C得分为0.485,提示保守性较低。MutationTaster2软件预测c.6900+2T>G和c.8819-3C>T均为致病性突变。结论:目的基因捕获结合二代测序技术可以对遗传性大疱性表皮松解症进行诊断和分型,发现COL7A1 c.6900+2T>G新发突变。

外显子捕获测序技术用于室间隔缺损胎儿遗传学病因检测

目的:探讨外显子捕获-高通量测序技术检测室间隔缺损(VSD)胎儿遗传学病因的可行性。方法:选择超声心动图诊断为VSD且微阵列比较基因组杂交(a CGH)和G显带检测结果均正常的19例胎儿作为研究对象;将已知的63个人类先心病致病基因作为检测靶点制作成捕获芯片,对各个样本DNA进行外显子捕获后高通量测序,数据经过滤、数据库比对、生物学软件分析得到最终病理性突变位点;病理性突变位点用Sanger测序验证。结果:19例VSD胎儿中共检测到1540个基因突变位点,数据库比对、生物信息学分析后得到8个病理性突变位点:JAG1 c.1078T>G(p.C360G),CHD7 c.6718G>T(p.D2240Y),NOTCH2c.6131G>A(p.R2044H),MYH7 c.77C>T(p.A26V),ZFPM2 c.2107A>C(p.M703L),CHD7 c.7198C>T(p.R2400W),HAND2 c.341G>A(p.S114N),MLL2 c.12140_12168del GGCCGTTAGCAATAGGAACTACCCCTGAG(p.G4047Vfs*5),其中MYH7、ZFPM2两个突变点为已报道突变,其余6例未见报道。8个突变位点的Sanger测序结果与高通量测序结果一致。父母溯源分析均为新发突变。结论:外显子捕获芯片用于VSD胎儿遗传学检测可提高阳性检出率,具有较好的临床应用价值。

软骨细胞中SIRT1基因敲减后作用状态不明确信号通路及对相关疾病或功能的影响

背景:沉默信息调节因子1以去乙酰化的方式调控软骨细胞中相关蛋白的功能,参与软骨细胞增殖分化,促进软骨缺损修复。目的:利用高通量技术筛选软骨细胞中沉默信息调节因子1基因敲减后作用状态不明确的信号通路以及产生变化的疾病或功能。方法:取处于对数生长期的小鼠ATDC5软骨细胞,分2组转染:对照组转染沉默信息调节因子1基因敲减阴性对照慢病毒,实验组转染沉默信息调节因子1基因敲减慢病毒。转染72 h后,利用小鼠基因表达谱芯片GeneChip®Mouse Genome 4302.0 Array检测mRNA的基因层面变化情况,应用生物信息学技术筛选激活或抑制不明确的信号通路以及这些信号通路相关因子,并分析疾病或功能模块的富集情况。结果与结论:①沉默信息调节因子1基因敲减后,小鼠ATDC5软骨细胞中激活或抑制状态不明确的信号通路有245条;②根据-log(P-value)排序选择排前20的激活或抑制状态不明确信号通路中的因子情况进行报道,包括IGFBP4、TGFBR1、CTGF、COL4A5、LHX2、IL1RL1、KLF6等;③根据-log(P-value)进行排序,细胞生长和增殖、生物体存活和细胞死亡与存活等14个疾病和功能密切相关模块明显变化;根据差异基因数量排序,生物体损伤和异常、癌症和细胞死亡与存活3个疾病和功能密切相关模块明显变化;根据-log(P-value)与差异基因数量综合排序,固有免疫应答这一疾病和功能模块被显著激活。

染料木素对人鼻咽癌CNE1细胞生长的抑制作用及靶点预测

目的:研究染料木素对人鼻咽癌CNE1细胞生长的抑制作用并预测其可能的作用靶点。方法:采用CCK-8法检测0(空白对照)、12.5、25、50、100、150μmol/L染料木素分别作用24、48、72 h对CNE1细胞增殖的影响;分别采用流式细胞术检测0(空白对照)、15、30、60μmol/L染料木素作用24 h对CNE1细胞周期、凋亡的影响;采用划痕实验检测0(空白对照)、10、20、30μmol/L染料木素作用24 h对CNE1细胞迁移能力的影响。采用高通量测序法挖掘0(空白对照)、30μmol/L染料木素作用24 h后CNE1细胞中的差异基因,并通过实时荧光定量-聚合酶链式反应法(RT-qPCR)对上述细胞实验相关差异基因mRNA的表达情况进行验证。结果:与空白对照比较,12.5、25、50、100、150μmol/L染料木素对细胞的增殖均有显著的抑制作用(P<0.01),且呈浓度-时间-效应趋势;15、30μmol/L染料木素可使细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.05或P<0.01),30、60μmol/L染料木素可使细胞周期阻滞于G2/M期并显著促进其凋亡(P<0.05或P<0.01);10、20、30μmol/L染料木素可显著抑制细胞的迁移能力(P<0.01)。高通量测序共挖掘出2271个差异基因(padj<0.05),其中1154个基因上调、1117个基因下调;结合细胞实验结果共筛选出p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、PI3K、AKT等8个潜在靶点差异基因。经RT-qPCR法验证,其中p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、AKT等7个潜在靶点差异基因mRNA的表达均显著下调(P<0.05),与转录组测序结果基本一致。结论:染料木素能有效抑制人鼻咽癌CNE1细胞的生长;其抗鼻咽癌机制可能与抑制突变型p53基因的表达,恢复野生型P53蛋白功能以及抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路的活性有关。

三例散发Ⅰ型神经纤维瘤病NF1基因突变检测

目的:对3例Ⅰ型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type1,NF1)患者及其家系进行致病基因突变检测。方法:应用目标序列捕获高通量测序技术对3例Ⅰ型神经纤维瘤病患者进行测序。患者检测出可疑突变类型后,应用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)及Sanger测序技术对患者及其家系成员进行突变位点验证。并采用SIFT、PolyPhen_2、Mutation Taster和GERP++软件对致病性不明的位点进行致病性预测。结果:3例Ⅰ型神经纤维瘤病患者分别检测到1个NF1基因变异:NF1基因整体杂合缺失、c.4064delC和Exon14_36del。其中c.4064delC与Exon14_36del未见文献报道,为新发突变。结论:本研究中3例Ⅰ型神经纤维瘤病患者中发现3个NF1基因突变,其中2个为新发突变,扩充了NF1基因突变位点。

2例散发型神经纤维瘤病病人及其家系NF1基因突变的检测

目的 报道2例Ⅰ型神经纤维瘤病(NF1)病人及其家系NF1基因检测结果。方法 应用目标序列捕获高通量测序技术对2例NF1病人及其家系进行NF1基因测序,明确那不然致病基因型,并采用多重连接探针扩增技术和Sanger测序法进行验证。结果 2例均检测到基因突变,1例为33岁孕6周女性,NF1基因整体杂合缺失,其丈夫和胎儿未检测到相同的基因突变;1例3岁男孩,为移码突变,基因型为c.6408delA,为新发突变。结论 我们进行高通量测序检测NF1基因变异,发现1个新发突变位点,扩充了NF1基因的致病性突变位点。另外,对胎儿进行NF1基因检测,可能是避免NF1患儿出生的一个措施。

Hemin诱导K562细胞分化前后PU.1全基因组结合位点探测

目的探讨K562细胞分化前后全基因组上的PU.1结合位点图谱及靶基因。方法用hemin对K562细胞诱导分化72 h,诱导分化前后的细胞利用PU.1抗体进行染色质免疫共沉淀实验,并进行高通量测序,利用生物信息学分析K562细胞分化前后PU.1在基因组上的结合位点,并进行基因注释、基因功能分析、KEGG通路分析及靶基因预测。结果发现K562细胞分化前PU.1结合位点有3107个,分化后的结合位点有1897个,共有的结合位点有843个。KEGG通路分析结果显示,分化后PU.1结合位点特有的信号通路有NF-κB信号通路,生长激素合成、分泌和运输通路,MAPK信号通路。K562细胞分化前后有1210个差异的PU.1结合位点,对应179个靶基因,其中分化相关的PU.1靶基因包括球蛋白基因、自噬相关基因、microRNA、非编码RNA以及转录因子。Motif分析结果显示,PU.1倾向于去结合ACTTCC特定序列。结论PU.1的基因组结合位点在K562细胞分化前后发生了显著变化,此研究结果为进一步揭示PU.1在血细胞中的功能及作用机制提供了依据。