高通量自动化类器官芯片研究进展

类器官是利用干细胞的自更新和自组织能力在体外构建的三维多细胞培养物,其复现了对应器官或组织的关键结构和功能特征,为发育生物学、再生医学、疾病建模和药物开发等领域提供了理想的体外模型和研究平台。然而,传统的类器官培养体系依赖于手动操作,培养流程较为繁琐,且培养物个体差异和批次差异较大,成为限制类器官转化和应用的重要原因之一。因此,工程化类器官培养体系通过引入微流控芯片技术来提升类器官培养体系的通量和自动化程度,对于实现类器官大规模、均质化、标准化培养具有重要意义。该文综述了高通量自动化类器官芯片的研究进展,并探讨了类器官培养通量和标准化的主要限制性因素和潜在挑战。

特异性抗肝癌单味中草药提取物的高通量筛选

目的利用高通量筛选分析技术评价单味中草药提取物对肝癌细胞及成纤维细胞的作用,以期获得具有特异性抗肝癌作用的中草药提取物。方法将242种常用单味中草药分别应用石油醚、乙醇或水进行提取,共获得554个中草药提取物。采用MTT来评价提取物对人肝癌细胞Bel7402和小鼠成纤维细胞NIH3T3存活的作用。结果提取物对人肝癌细胞Bel7402及成纤维细胞NIH3T3生长抑制作用>50%的样品分别占总样品数的7.4%和14.8%,对2种细胞抑制率同时>50%的样品占总数的4.4%,对Bel7402抑制率为对NIH3T3抑制率2倍以上且对Bel7402抑制率>50%的样品占总样品数的1.6%。复筛结果显示,防己乙醇提取物(DF173)对肝癌细胞的细胞毒作用特异性较好,具有良好的量效关系。DF173对Bel7402细胞毒作用IC50为8.27 mg·L-1,对NIH3T3的细胞毒作用IC50为19.48 mg·L-1。结论肿瘤细胞联合正常成纤维细胞筛选评价中草药提取物特异性抗肿瘤作用,有利于发现高效、低毒抗肿瘤中草药提取物。

激活素受体样激酶4,5和7抑制剂体外高通量筛选模型的构建

目的构建适于高通量筛选的激活素受体样激酶4(ALK4),ALK5和ALK7抑制剂的筛选模型。方法利用Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统,构建ALK4激酶结构域(ALK4kd),ALK5kd和ALK7kd及Smad2和Smad3蛋白的病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,表达目的蛋白;通过谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和柱纯化,获得纯化的目的蛋白;分别以纯化的ALK4,ALK5,ALK7激酶片段与纯化的Smad3和ATP构建ALK4,ALK5,ALK7激酶活性测定体系,优化各反应底物浓度及反应条件,建立适于通量化分析的筛选模型;以已知ALK激酶抑制剂SB431542为工具分子,检测其对激酶的抑制活性,确证筛选模型的可靠性。结果经酶切和PCR鉴定,所得重组Bacmid均正确。转染Sf9昆虫细胞后纯化获得相应目的蛋白。经条件优化,反应体系中激酶和底物蛋白Smad3最佳浓度均为10 mg·L^(-1),ATP最佳初始浓度为10 nmol·L^(-1)。所得ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制剂筛选体系的Z′因子分别为0.71,0.51和0.74,符合高通量筛选要求。已知SB431542在所建模型上对ALK4kd,ALK5kd和ALK7kd的抑制活性IC50值分别为22,188和91 nmol·L^(-1)。结论成功构建了ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制剂的体外筛选模型。

高通量筛选酸敏感离子通道1a抑制剂研究

目的建立体外稳定过表达酸敏感离子通道1a(ASIC1a)的Fisher大鼠甲状腺上皮细胞(FRT细胞),采用Ca^(2+)敏感荧光染料Fura-2/AM和细胞毒性检测〔乳酸脱氢酶(LDH)释放法〕测定ASIC1a活性,探讨高通量筛选ASIC1a抑制剂的可行性。方法2014年1月—2016年2月,利用分子生物学方法,构建ASIC1a过表达载体pc DNA3.1/myc-His-m ASIC1a,通过细胞转染技术建立了稳定过表达ASIC1a的Fisher大鼠FRT细胞。将细胞分成两组,对照组(FRT细胞)和实验组(稳定过表达ASIC1a的FRT细胞),并分别未负载和负载Ca^(2+)敏感荧光染料Fura-2/AM,采用酶标检测仪测定双波长(340 nm和380 nm)的值,计算F340/F380。对照组和实验组细胞经不同p H值酸液(p H值7.5、7.0、6.5、6.0、5.5)刺激后,采用酶标检测仪测定450 nm波长处LDH释放量。结果对照组与实验组未负载Fura-2/AM细胞F340/F380比较,差异无统计学意义(P>0.05);实验组负载Fura-2/AM细胞F340/F380较对照组升高(P<0.05);对照组和实验组负载Fura-2/AM细胞F340/F380较未负载Fura-2/AM细胞升高(P<0.05)。p H值6.5、6.0、5.5时,实验组细胞LDH释放量大于对照组(P<0.05);对照组和实验组细胞不同p H值时LDH释放量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究成功建立稳定过表达ASIC1a的FRT细胞,Ca^(2+)敏感荧光染料Fura-2/AM和细胞毒性检测(LDH释放法)两种方法测定ASIC1a活性,使高通量筛选ASIC1a抑制剂成为可能,为发现高选择性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制剂奠定了基础。

高通量结核分枝杆菌蛋白可溶表达筛选平台的构建与应用

目的为了改变结核分枝杆菌蛋白质的结构与功能研究由于受结核分枝杆菌蛋白难以可溶性表达和纯化的影响而进展缓慢的问题。方法将多个能促进可溶性表达的蛋白标签与高通量的Gateway克隆技术相结合，构建结核分枝杆菌蛋白可溶性表达快速通量的筛选平台。挑选46个不同分子量且已知以包涵体形式表达或者不表达的结核分枝杆菌蛋白的基因，分别克隆到带有N-末端的氮源利用物质A（N utilization substance A，NusA）、小分子泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier-1，SUMO）、麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein，MBP）、硫氧还蛋白（thioredoxin A，TrxA）、酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）五种蛋白标签基因的载体上，进行融合表达，分析比较各标签促进可溶性表达的效果。结果融合NusA标签后，19个蛋白以可溶性形式表达，占总样本的41％（19／46）；同时融合SUMO、MBP、TrxA、ACP标签后，可溶性表达的蛋白也分别达到总样本数的22％（10／46）、26％（12／46）、26％（12／46）、22％（10／46）。结论结核分枝杆菌蛋白可溶性表达快速通量筛选平台的建立，实现了结核分枝杆菌重组蛋白可溶性表达的快速通量筛选，为更进一步研究结核分枝杆菌蛋白、特别是重要药物靶标蛋白的结构与功能创造了条件。

靶向PLK1 PBD小分子抑制剂荧光偏振高通量筛选模型的建立

目的建立适用于靶向PLK1 PBD小分子抑制剂规模化筛选的荧光偏振高通量筛选模型。方法以pE T-28a-PLK1 PBD质粒转化E.coli Rosetta BL21(DE3),诱导表达并纯化PLK1 PBD蛋白。利用荧光偏振原理,以FITC-Poloboxtide作为分子探针,优选分子探针和PLK1 PBD最佳工作浓度,建立适用于PLK1 PBD小分子抑制剂筛选的荧光偏振高通量筛选模型。同时采用上述建立的荧光偏振筛选模型检测poloxin的抑制活性。结果成功诱导表达并纯化PLK1 PBD蛋白。选用30 nmol/L分子探针和200 nmol/L PLK1 PBD蛋白建立荧光偏振高通量筛选模型,其Z'因子可达0.74。基于该方法,检测poloxin的抑制活性,其IC_(50)值为(4.27±0.69)μmol/L。结论成功建立了适用于靶向PLK1 PBD小分子抑制剂筛选的荧光偏振高通量筛选模型。

自动化高通量提取脱落细胞检材DNA

脱落细胞是目前法医DNA检验中的重要裣材之一,此类物怔具有体积小、较为隐蔽、不易察觉、不易毁灭等特点.通过提取脱落细胞中的DNA,可以直接获取犯罪现场人员信息,为案件侦破提供重要技术支持.但在现场检材中通常仅能采集到微量的脱落细胞,且常常带有扩増抑制物,手工进行DNA提取操作复杂,提取效果因人而异,给DNA检验带来了诸多困难.为有效提髙脱落细胞的获取量,必然要增加现场采样的数量。

埃博拉病毒进入抑制剂筛选模型的建立与应用

目的旨在以埃博拉病毒(EBOV)包膜糖蛋白(GP)为靶点,建立埃博拉病毒进入抑制剂高通量筛选模型,应用该模型筛选具有特异性抑制埃博拉病毒进入的活性样品。方法利用细胞水平重组病毒技术,分别用两株不同爆发时间的Zaire-EBOV的GP与HIV核心质粒(p NL4-3.Luc)共表达,制备重组病毒EBOV-GP-Old/HIV-luc和EBOV-GP-New/HIV-luc。利用ELISA和荧光素酶检测技术,优化病毒产量、感染性、感染剂量及荧光活性测定时间等因素,建立药物筛选模型。利用统计学参数及阳性化合物评估该模型的稳定性和灵敏性。应用该模型,对242个样品进行初步筛选,并通过与水泡性口膜炎病毒包膜蛋白包装的重组病毒VSVG/HIV-luc进行比较,以判断样品的特异性。结果该模型可用于靶向GP蛋白的埃博拉病毒进入抑制剂的高通量筛选,并获得4种具有特异性抗埃博拉进入活性的样品。结论该模型可用于抗EBOV进入药物的高通量筛选,应用该模型获得的阳性样品有助于抗EBOV药物的发现。

抗寨卡病毒药物筛选模型的建立及其应用

目的建立寨卡病毒抑制剂高通量筛选模型,为筛选和评价抗寨卡病毒化合物提供技术手段。方法利用CCK-8法测定寨卡病毒感染后细胞活性,间接反应胞内病毒复制水平。进而对分析方法进行优化,建立可定量病毒复制能力的药物筛选模型,并利用统计学分析对模型的稳定性和灵敏性进行评价。应用该模型对32 000个微生物发酵液进行初步筛选,验证该方法的可行性。结果成功建立寨卡病毒抑制剂高通量筛选模型,该筛选模型具有较好的稳定性和灵敏度,Z'因子为0.733,CV为5.52%,S/B为20.21,S/N为14.18。利用该模型筛选得到阳性样品102个,对其中I07A-01164进行抗病毒活性验证,测定其稀释4倍后可以抑制50%以上的病毒复制。结论建立了抗寨卡病毒化合物的高通量筛选模型,可用于寨卡病毒抑制剂的筛选和活性初步评价,有助于抗寨卡病毒药物的发现。

基于细胞高内涵分析表征氮芥HN-3的细胞毒性

目的研究氮芥HN-3对不同来源细胞的毒性表型特征。方法 HN-3100,300和450μmol·L^(-1)分别作用于原代人胚表皮角质细胞(HEKf),原代成人皮肤成纤维细胞(HDFa)和人肺成纤维细胞(HLF)0.5,2,4,6,8,24和48 h后,采用基于细胞成像的多参数分析技术,检测HN-3对细胞存活、细胞核、细胞骨架(微丝和微管)、线粒体膜电位(MMP)、氧化应激、核膜通透性(NMP)、磷酸化组蛋白、溶酶体、自噬、细胞周期和凋亡等参数的影响。结果 HN-3引起不可逆性的细胞损伤,表现为存活细胞数量显著减少(P<0.01)。在存活细胞数量显著减少前,从0.5 h开始,细胞内活性氧和磷酸化组蛋白水平即显著升高,谷胱甘肽含量显著降低(P<0.01)。HEKf细胞内溶酶体在0.5 h时减少,而HDFa和HLF细胞内溶酶体则分别在0.5和2 h升高,并伴有微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)蛋白表达升高伴随存活细胞数量减少,HEKf细胞核亮度升高,核面积减少,微丝、微管亮度和面积减少,MMP显著降低(P<0.01),溶酶体亮度有增加趋势;与此相反,HDFa和HLF细胞表现为核面积增加,微丝、微管亮度和面积增加,MMP显著升高(P<0.01),但溶酶体亮度增加,且HLF细胞LC3B的含量显著升高(P<0.01);同时,3种细胞均有NMP增高和锰超氧化物歧化酶含量增加,G2期阻滞。此外,HEKf细胞出现早期和晚期凋亡,HDFa细胞出现早期凋亡。结论 HN-3诱发早期的细胞损伤效应包括DNA损伤、氧化胁迫和溶酶体损伤,晚期导致MMP失衡、NMP增加、G2期细胞周期阻滞;此外,HN-3特异性地诱导HEKf细胞核固缩、细胞骨架蛋白核聚集和细胞凋亡;诱导HDFa和HLF细胞核肿胀和细胞骨架松散,并最终导致HDFa细胞早凋和HLF细胞自噬性死亡。

FoxO1抑制剂细胞筛选模型的构建与应用

目的构建含有人叉头框蛋白O1(FoxO1)结合靶位点(即胰岛素反应元件,IRE)的以萤火虫荧光素酶(Luc2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为双报告基因的FoxO1抑制剂高通量筛选细胞模型,进行FoxO1抑制剂的筛选,并对获得的阳性化合物细胞活性进行初步研究,以期获得能够调节糖脂代谢紊乱相关疾病的先导化合物或候选药物。方法用分子生物学的方法,构建含有胰岛素反应元件的并连接Luc2和EGFP双报告基因的重组载体pc-IRE-LE。将体外培养的HEK293T细胞用该重组载体进行瞬时转染,分别利用萤火虫荧光素酶试剂盒和荧光显微镜对荧光素酶活性及绿色荧光蛋白表达进行检测,从而构建细胞模型并对其进行进一步优化和评价。应用该细胞模型对化合物库进行高通量筛选,随后利用实时定量RT-PCR的方法对筛选获得的阳性化合物的FoxO1抑制剂活性,即对FoxO1多个糖脂代谢相关靶基因mRNA表达进行检测。结果成功构建了具有Luc2和EGFP双报告基因的FoxO1抑制剂高通量筛选细胞模型,并完成了模型评价。经过对6000余个化合物的筛选,共获得6个具有明显的剂量-效应关系的阳性化合物。其中化合物7625-H9在模型上表现出良好的FoxO1抑制剂活性,并在细胞上对FoxO1多个靶基因PEPCK、G6Pase、apoC-Ⅲ和MTP的mRNA水平均有显著的抑制作用。结论该模型符合高通量筛选的要求,可用于FoxO1抑制剂的高通量筛选。该模型的应用将为新型调节糖脂代谢紊乱药物的发现提供一个可靠而有效的方法。

高通量测序筛选与骨肉瘤化疗耐药相关的环状RNA分子表达谱

目的通过高通量测序筛选与骨肉瘤化疗耐药相关的环状RNA表达谱,并初步分析、鉴定其可能的分子功能。方法采用CCK-8实验检测三对配对的耐药和敏感人骨肉瘤细胞系(MG63/DXR vs MG63、U2OS/DXR vs U2OS、KHOS/DXR vs KHOS)对于三种常用骨肉瘤化疗药物(多柔比星、顺铂、甲氨蝶呤)的敏感性。后采用下一代高通量RNA测序技术,在三对配对的化疗多药耐药和敏感的人骨肉瘤细胞系中进行circRNA表达谱的比较分析。使用实时定量PCR(qRT-PCR)在化疗耐药骨肉瘤细胞系和组织中确认测序数据的可靠性和准确性。此外,还进行包括GO、KEGG通路分析和circRNA-miRNA网络构建在内的多种生物信息学分析,以预测差异表达的circRNA的潜在分子功能,构建相关的可能调控通路或网络。结果三种骨肉瘤耐药细胞(MG63/DXR、U2OS/DXR、KHOS/DXR)对于三种常见的骨肉瘤化疗药物均较对照组细胞(MG63、U2OS、KHOS)具有明显的抵抗性;RNA测序共检测到80个组间差异表达的circRNAs,相对于药物敏感的骨肉瘤细胞,药物抵抗骨肉瘤细胞系中,57个circRNAs表达上调,23个circRNAs表达下调(组间差异倍数≥2或≤0.5)。随机选择其中的10个circRNA行qRT-PCR验证,发现有9个qRT-PCR的检测结果与测序结果一致;此外,KEGG通路分析结果显示56个通路在差异表达的circRNAs中被显著富集,包括糖酵解/糖异生、ABC转运蛋白、VEGF信号通路等等。此外,发现在化疗耐药的骨肉瘤细胞和组织中,上调倍数最高的circRNA-hsa_circ_0004674明显高表达,与骨肉瘤患者的预后不良有关。通过权威数据库(TargetScan和miRanda)和文献搜索,构建了与hsa_circ_0004674相关的一些潜在的内源竞争性RNA(ceRNA)调控通路,例如hsa_circ_0004674-miR-490-3p-ABCC2和hsa_circ_0004674-miR-1254-EGFR等,并预测了与hsa_circ_0004674存在潜在ceRNA调控关系的miRNA之间的miRNA反应元件序列。结论CircRNA与肿瘤的进展密切相关,可能在骨肉瘤化疗耐药中发挥作用,而hsa_circ_0004674可能是逆转耐药性的潜在候选靶点。

孕妇外周血微小RNA异常表达谱的鉴定及对妊娠期糖尿病的诊断价值研究

目的对孕妇外周血微小RNA(miRNA)异常表达谱进行鉴定并探讨对妊娠期糖尿病(GDM)的诊断价值。方法选择2018年1月至2020年2月成都市双流区第一人民医院收治的62例GDM孕妇(GDM组)及62例糖耐量正常(NGT)的孕妇(NGT组)为研究对象,在妊娠晚期(26~40周)收集孕妇外周血,利用最新高通量测序技术鉴定外周血中差异性表达的miR‐NAs,利用RT-PCR验证鉴定的靶点。统计分析筛选的差异性miRNA与临床参数的相关性及对GDM发生的影响。结果与NGT组相比,GDM组外周血共检测到157个差异表达的miRNAs,其中114个表达上调,43个表达下调。层级聚类显示GDM组与NGT组的miRNA图谱明显不同,其中8个miRNAs显著上调,6个miRNAs显著下调。利用qPCR验证在外周中高表达且最可能与能量代谢相关的差异表达的miRNAs,qPCR结果显示NGT组、GDM组miRNA-125b的相对表达水平分别为5.83±1.31、1.34±0.30,miRNA-543的相对表达水平分别为0.93±0.21、0.22±0.06,miRNA-144的相对表达水平分别为0.42±0.19、1.32±0.28,与最新高通量测序结果一致。与非妊娠期糖尿病孕妇相比,妊娠期糖尿病孕妇外周血中miRNA-125b表达下调(P<0.001),miRNA-144表达上调(P<0.001)。多因素分析结果显示,miRNA-125b、miRNA-144和孕前体质量指数是影响GDM发病的独立性危险因素(P<0.05)。结论在GDM病人的外周血中,miRNA-125b和miRNA-144的表达处于失调状态,对妊娠期糖尿病有很好的诊断价值。

代谢组学在单细胞领域应用的研究进展

单细胞代谢组学(SCM)是以高通量检测和数据处理为手段,以组群指标分析为基础,以信息建模和系统集成为目标,对特定生理时期的某种细胞的所有小分子量代谢物进行定量和定性分析。本文综述了近年来代谢组学在单细胞领域中的研究及应用进展,并对其在医学领域的最新应用进行了详细的讨论。

基于毒性通路扰动的药物安全性评价新策略

安全性是决定创新药物研发成败的关键因素。传统的药物毒性测试与安全性预测面临严峻挑战。基于毒性通路扰动的毒性测试策略已成为药物安全性评价的重要发展方向。本文针对传统毒性测试方法存在的问题,简要介绍了毒性通路的内涵及其毒理学意义,重点阐述了基于毒性通路扰动的安全性评价新策略的提出及其发展,并以药物线粒体毒性预测为例,介绍了毒性测试新策略的原理及应用,为药物安全性评价的发展提供新的思路。

缺血性卒中不同亚型患者血浆miRNAs表达谱变化分析

目的研究缺血性卒中不同亚型患者血浆中miRNAs表达谱的差异。方法选取2012年11—12月于青岛大学附属医院神经内科就诊的首次发病的16例急性缺血性卒中患者，按TOAST分型将其分为大动脉粥样硬化性（large artery atherosclerotic，LAA）卒中组8例，小动脉闭塞性（small artery occlusion，SAO）卒中组8例，以及同期健康体检者8名作为对照组，应用高通量测序法检测各组血浆中miRNAs的表达谱，筛选出差异表达的miRNAs，实时荧光定量PCR验证结果，并进行靶基因预测及生物信息学分析。结果LAA组、SAO组及对照组血浆中分别检测到369个miRNAs成熟体。通过miRNAs差异分析，发现let-7a-5p、miR-744—5p等12个miRNAs在3组中均呈现差异性表达（表达差异均大于2倍，P〈0．01）；与对照组比较，miR-126-5p、miR-23a-3p、miR-143—3p等34个miRNAs在LAA组表达显著下调（表达差异均大于2倍，P〈0．01）；在SAO组中miR-1304-3p、miR-451a较对照组表达显著下调（表达差异均大于2倍，P〈0．01），而miR-320a、miR-320b、miR-99b-5p等27个miRNAs较对照组表达则显著上调（表达差异均大于2倍，P〈0．01）。实时荧光定量PCR对其中的miR-146b-5p、miR-23a-3p、miR-451a的验证结果与高通量检测结果一致。生物信息学分析发现，差异表达的miRNAs调控的靶基因主要与细胞增殖、黏附、代谢等生物学功能相关。结论LAA型卒中患者及SAO型卒中患者血浆miRNAs表达谱存在明显差异，提示miRNAs可能通过靶基因在LAA及SAO的发病过程中发挥不同的调节作用。

加权基因共表达网络分析技术在人类肿瘤研究中的应用

加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)技术是一种在高通量基因表达数据中,利用系统生物学思想,寻找基因表达相关性,并构建基因模块,进而发现具有生物学意义模块的高通量数据挖掘算法。近年来,随着人类对疾病的认识深入到基因水平,WGCNA越来越多的应用于各种疾病,尤其在肿瘤相关基因的高通量数据的挖掘之中。并且,随着技术的不断完善,该技术在疾病的发病机制、发展过程和治疗方案等的探索中,由单一的共表达网络分析逐渐发展成为与多种技术诸如基于连锁不平衡的全基因组关联分析、支持向量机联合应用以及创新性应用WGCNA进行高通量数据挖掘。作为基于基因层次的高通量研究方法,WGCNA正发挥着重要作用。

基于生物信息学的非同义单核苷酸多态性功能预测策略

非同义单核苷酸多态性(ns SNPs)的功能预测因生物信息学的发展而成为可能并发展迅速,已经越来越多地用于识别引起人类疾病及影响药物敏感性的突变,尤其是罕见的孟德尔遗传病和药物抵抗。鉴于不同的数据库收录ns SNPs的情况及各种生物信息学方法的算法原理各有优势和局限性,需综合多种数据库的资源并利用不同算法原理的生物信息学方法来提高ns SNPs的功能预测精度。本文对ns SNPs功能预测过程中涉及的数据获取资源、生物信息学方法及综合预测策略作一综述。