高钾离子引起PC12细胞内游离Ca^(2+)浓度升高的机制

目的：分析高钾离子（Ｋ＋）引起ＰＣ１２细胞内游离钙离子浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）升高的可能机制。方法：利用ＭｉｒａＣａｌＩｍａｇｅＳｙｓｔｅｍ检测［Ｃａ２＋］ｉ，Ｃａ２＋荧光探针为Ｆｕｒａ－２／ＡＭ。结果：（１）ＫＣｌ浓度为３０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ时，可剂量依赖性地诱导ＰＣ１２细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高；（２）在细胞外无Ｃａ２＋时，高Ｋ＋对ＰＣ１２细胞［Ｃａ２＋］ｉ无影响；（３）Ｌ－型电压门控钙通道阻滞剂维拉帕米、地尔硫和硝苯地平的浓度分别为５×１０－５，１×１０－４和５×１０－３ｍｏｌ／Ｌ时，可完全阻断高Ｋ＋诱导的ＰＣ１２细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高，但Ｎ－型电压门控钙通道阻滞剂ω－ｃｏｎｏｔｏｘｉｎＧＶＩＡ在浓度为１×１０－６ｍｏｌ／Ｌ时，对高Ｋ＋诱导的ＰＣ１２细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高没有影响；（４）５×１０－５ｍｏｌ／Ｌ维拉帕米对细胞外由无Ｃａ２＋到有Ｃａ２＋过程引起的［Ｃａ２＋］ｉ升高无抑制作用。结论：高Ｋ＋引起ＰＣ１２细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高以细胞质膜上Ｌ－型电压门控Ｃａ２＋通道开放为基础。

糖皮质激素快速抑制高钾离子诱导嗜铬细胞瘤细胞内游离钙浓度升高的作用及其特征

本研究应用钙离子特异荧光指示剂Fura－2／AM，使用Miracal影像系统（MiracalImageSystem）检测了糖皮质激素对高钾离子升高嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）内游离钙浓度（[Ca2+]i）作用的影响。结果表明：（1）皮质酮抑制高钾离子诱导PC12细胞[Ca2+]i升高与其预处理细胞时间的长短有关，预处理3min时，皮质酮开始产生抑制作用；预处理5min时，其呈现的抑制作用最强；预处理25min时，抑制作用基本消失。（2）皮质酮在10－8～10－5mol／L范围内时可呈剂量-效应关系，抑制高钾离子诱导的PC12细胞[Ca2+]i升高，皮质团浓度为10－5mol／L时，其产生的抑制作用最大；在10－9mol／L时抑制作用不明显。（3）其它自体激素如皮质醇。地塞米松、孕酮、雌二醇、睾酮、醛固酮在浓度为10－5mol／L时，也能抑制高钾离子引起的PC12细胞[Ca2+]i升高，但在同一浓度时作用强度有所不同。胆固醇浓度为10－5mol／L时，对高钾离子诱导PC12细胞钙浓度升高没有抑制作用。在同一浓度时它们的作用强度顺序大致为：孕酮＝皮质醇＞地塞米松＞睾酮＞醛固酮＝雌二醇＞＞胆固醇。（4）在皮质酮浓度为10－5mol／L时不能抑制由细胞外无钙到有钙过程引起的PC12细胞[Ca2+]i升高。

海蓬子中高亲和钾离子转运体SbHKT1基因的克隆、表达及生物信息学分析

本研究利用RACE技术从真盐生植物海蓬子中获得了高亲和钾离子转运体SbHKT1基因1647bp完整的ORF框。序列分析结果表明,该基因编码548个氨基酸,分子量为62.10kD,理论等电点为9.33;氨基酸序列中第1个～第35个属信号肽序列,第197个～第537个属离子转运体(TrkH)家族特征序列;该基因编码的蛋白具有10个跨膜结构,N端跨膜区及中部膜上呈现明显的疏水性,C端及中部多个跨膜区呈现强疏水性,符合载体类运输蛋白的特点,因此推测SbHKT1蛋白为跨膜运输蛋白。Blast分析显示该蛋白与碱蓬SsHKT1氨基酸同源性高达77%,与冰叶日中花、赤桉和小麦HKT类蛋白的同源性分别为63%、52%和46%。SbHkt1基因表达存在组织特异性:正常生长条件在根、茎中表达较低,在叶片中几乎看不到表达;在高盐低钾的环境下,各组织表达明显升高,高盐低钾胁迫处理8h,其根部表达处于高峰期;经100μmol/L脱落酸处理4h,根部表达达到最高;干旱胁迫(20%PEG6000)处理2h,根部表达量明显上升。由此推断,该基因参与了植物在高盐低钾、渗透、干旱等非生物胁迫下的生理调控。由于目前已克隆的HKT类蛋白基因多来自非盐生植物,对盐生植物内源HKT基因的研究相对较少,因此,海蓬子内源HKT1基因的全长的获得有助于我们进一步研究该基因在高盐钾饥饿环境下运输钾离子,调节植物体内Na+/K+平衡的功能,对于揭示真盐生植物的耐盐机制,将其运用于非盐生植物,培育新的耐盐品种具有一定的意义。

盐角草高亲和钾离子转运蛋白SeHKT1基因的克隆及表达分析

利用RACR技术从盐生植物盐角草中克隆Se HKT1基因,Gen Bank登录号为KP739261,用生物信息学方法对获得的基因序列进行分析,利用q RT-PCR方法研究Se HKT1基因在不同组织和不同盐胁迫下的表达特性。结果表明,该基因c DNA序列含有1个1 761 bp的完整ORF,编码550个氨基酸,Blast分析表明该蛋白与毕氏海篷子Sb HKT1蛋白亲缘关系较近。q RT-PCR分析表明Se HKT1基因在Na Cl处理下地上部和地下部均诱导上调表达,主要在盐角草根部表达,在地上部表达相对较低,200mmol/L Na Cl处理6 h后在根部表达量达到最高,随后逐渐降低;在钾饥饿条件下,该基因在根部和地上部的相对表达量均高于对照。说明Se HKT1不仅能响应N a Cl胁迫,还能在缺钾条件下提高表达,发挥高亲和钾离子载体功能。

商陆PaHAK1与拟南芥HAK/KUP/KT家族基因的比较分析

为探明商陆高亲和性K+转运体基因(Pa HAK1)的结构、功能及商陆耐低钾的原因,分析比较了商陆Pa HAK1和拟南芥HAK/KUP/KT家族基因中15个基因编码的高亲和性钾离子转运体氨基酸序列、蛋白质结构及其理化性质。结果表明:HAK基因家族编码蛋白均定位于细胞膜上,含有多个跨膜结构且跨膜结构域是蛋白质的保守结构域;Pa HAK1与At KUP3的跨膜结构十分相似,低钾胁迫下Pa HAK1和At KUP3的高表达与其高亲和钾转运吸收功能密切相关。系统进化树分析结果表明,Pa HAK1与拟南芥HAK基因家族中At KUP8亲缘关系最近,其氨基酸序列相似度为76.98%,推测Pa HAK1还可能通过维持细胞内高水平钾量在水分胁迫下发挥重要的调节作用。

CD1小鼠动脉导管Kca mRNA表达情况研究

目的 研究高电导钙离子激活的钾通道 (Kca)mRNA在妊娠晚期胎鼠和新生CD1小鼠动脉导管(DA)上的表达情况 ,以期阐明Kca在小鼠DA关闭调控方面的作用。方法 采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)和Southern杂交方法 ,检测了经剖宫产分娩的妊娠d1 7、d1 8和d1 9CD1胎鼠 ,以及自然产d1新生小鼠DAKcamRNA的表达情况。结果 KcamRNA表达于胎鼠DA ,以d1 9表达水平最高 ,但新生小鼠DA无KcamR NA表达。结论 KcamRNA在胎鼠DA有表达 ,但出生后无表达 ,提示在宫内低氧环境中Kca可能是维持DA开放状态的一个重要因素 。

三种盐生植物与三种甜土植物HKT1生物信息学比较分析

为研究三种盐生植物与三种甜土植物中高亲和性钾离子转运蛋白(HKT1)在结构和功能等方面的差异,本研究运用生物信息学方法预测并分析三种盐生植物与三种甜土植物HKT1的理化特性、氨基酸组成、亲/疏水性、N-糖基化位点、信号肽、跨膜结构域及其同源进化关系等,对预测及分析数据进行分类对比,总结共性且筛选差异性。结果表明:三种盐生植物和三种甜土植物的HKT1氨基酸组成、亲/疏水性、N-糖基化位点差异不明显,但是信号肽、同源序列分析及多重序列比对分析存在明显的差异,上述差异可为改良和育种耐盐碱性基因工程作物提供一定的理论依据。

蓖麻耐盐基因HKT的克隆及表达载体构建

为挖掘蓖麻耐盐相关基因,以盐生植物蓖麻(Ricinus communis L.)叶片为材料。设计特异性引物,克隆高亲和性钾离子转运蛋白(high-affinity K+transporter,HKT)耐盐基因,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明,该基因全长1 596 bp,编码531个氨基酸,推测分子量为59.74 kD,等电点(pI)为9.32。多重序列比对和系统发育树分析表明该蛋白与木薯和橡胶树的同源性最高,分别为69.13%和67.03%,且与HKT1蛋白家族成员同源性较高,为S-G-G-G类型蛋白,推测该蛋白为HKT1类蛋白。二级结构预测蓖麻HKT蛋白有9个跨膜结构域,主要定位于内质网上,是典型的跨膜蛋白。根据蓖麻HKT基因序列设计带有Bam HⅠ和PstⅠ酶切位点的引物扩增出全长基因,用限制性内切酶Bam HⅠ和PstⅠ进行双酶切后与表达载体pCHF-3300连接。本研究成功构建了蓖麻HKT基因的表达载体,为进一步研究该基因的转化及功能验证提供参考。