高AT含量DNA片段PCR扩增体系的优化

选用4种不同长度(1.0~5.4 kb)、高AT含量(72%~80%)的真菌线粒体DNA片段,通过比较4种PCR添加剂(牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺和镁离子)和4种KOD系列DNA聚合酶(KOD-Plus-、KOD-Plus-Neo、KOD FX和KOD FX Neo)对PCR扩增效果的影响,优化高AT含量DNA片段的PCR扩增体系。结果表明:当PCR体系中单独使用1种添加剂时,只有镁离子能够促进扩增,其他3种添加剂都不能产生预期扩增条带。BSA和DMSO对镁离子的扩增促进作用无负面影响,而甲酰胺会抑制镁离子的扩增促进作用。当镁离子存在时,4种KOD聚合酶的PCR体系均可获得预期的扩增产物;当缺乏镁离子时,使用KOD-Plus-或KOD-Plus-Neo聚合酶的PCR体系未能得到扩增产物,表现出对镁离子的依赖性。镁离子对高AT含量DNA片段的扩增具有促进作用,最佳使用浓度为1.75 mmol/L。研究结果为其他真核生物中高AT含量DNA片段的扩增提供了方法依据。

大豆DNA片段导入玉米自交系提高蛋白质含量的研究

采用花粉管通道法把大豆DNA片段导入玉米骨干自交系,对诱变玉米籽粒材料进行了籽粒总蛋白含量及醇溶蛋白和谷蛋白含量的测定。结果表明:(1)处理后的38个材料总蛋白含水量都比较高,与各自的对照相比,除1DA2、1DA6上、1DA3、26DB1、26DA4外差异都达显著或极显著水平;(2)醇溶蛋白含量测定中,选了4个处理材料,其中1DA5、26DB4、26DC6含量都比对照高,5DB2含量较对照降低了8 76%;(3)谷蛋白含量测定中,1DA5、26DB4的含量较对照低,5DB2、26DC6的含量比对照高,其中5DB2的增加比例达到23 7%。上述结果初步证明高蛋白特性是可遗传的,这为选育高蛋白玉米新自交系提供了新材料,也为利用外源DNA直接导入技术创造玉米新种质开辟了新途径。

高丹草超低氢氰酸含量ISSR特征片段的克隆及序列分析

为明确高丹草超低氢氰酸含量ISSR特征片段的DNA分子特征,以散穂高粱×黑壳苏丹草杂种F2的3个超低氢氰酸含量ISSR特征片段H-1、H-2、H-3和散穂高粱×白壳苏丹草杂种F2的3个超低氢氰酸含量ISSR特征片段B-1、B-2、B-3为材料,对6个不同的ISSR特征片段进行了克隆和测序分析。结果表明:克隆的特征片段H-1序列全长为1377bp,序列包含1个357bp的完整编码区(ORF),位于743～1099bp区域,共编码119个氨基酸,片段与小麦亚种蛋白b的同源性为60%。片段H-2序列全长2268bp,序列包含1个279bp的ORF,位于735～1013bp区域,共编码93个氨基酸,片段与高粱假设蛋白SORBIDRAFT_05g027190同源性为63.9%,与水稻粳稻组假设蛋白OsJ_07776同源性为62%。片段H-3序列全长2614bp,序列包含1个339bp的ORF,位于1024～1362bp区域,共编码113个氨基酸。片段B-1序列全长1432bp,序列包含1个300bp的ORF,位于700～999bp区域,共编码100个氨基酸。片段B-2序列全长1363bp,序列包含1个228bp的ORF,位于603～830bp区域,共编码76个氨基酸。片段B-3序列全长2751bp,序列包含1个186bp的ORF,位于2534～2719bp区域,共编码62个氨基酸。片段H-3、B-1、B-2、B-3与现有已知的植物碱基序列和氨基酸序列没有同源性,可能是与高丹草超低氢氰酸含量关系更为密切的DNA新序列。

通过PCR技术简单扩增奶牛高GC含量的rDNA重复序列

为了探索利用PCR简单扩增高GC含量的长重复序列的方法,经反复摸索后选用LAPCR法即LAPCRTaq酶结合GC缓冲液Ⅱ来扩增奶牛高GC含量的长片段重复序列,成功获得了全长2538bp,GC含量为65.7%的DNA序列,其中ITS1的GC含量高达80%.探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用等措施.

高GC含量DNA模板的PCR扩增

目的：探索高GC含量DNA的PCR扩增条件，为扩增达托霉素生物合成基因簇及拼接奠定基础。方法：在PCR扩增体系中，使用高保真的聚合酶及添加不同浓度的DMSO、7-deaza-dGTP等增强剂，并选择合适的PCR循环程序，优化富含GC的DNA的PCR扩增条件。结果：向反应体系中额外添加1%~4%的DMSO可以显著提高富含GC的DNA的PCR扩增产物量，但会降低其特异性；7-deaza-dGTP可以提高扩增产物的特异性及保真度，但产量会有所下降。应用touch down PCR并在体系中添加7-deaza-dGTP能够提高扩增产物的特异性和产率，增加扩增的保真度。结论：应用优化的PCR扩增条件将所有达托霉素生物合成基因簇分段扩增出来，并可扩增出长达6 kb的片段，且序列完全正确，可以进行后续拼接。

沼泽红假单胞菌GroE基因高保守区DNA片段的克隆,测序和特性分析

利用原核微生物GroE基因特定区域高保守性设计了简并引物 ,以RhodopseudomonaspalustrisY6的染色体为模板进行PCR扩增 ,得到片段 5 94bp的产物 .将该DNA片段连接到pUC -T载体多克隆位点上 ,转化大肠杆菌DH5α菌株 ,得到阳性重组子 .经Southern杂交验证 ,已克隆的 5 94bpDNA片段来自Rhodopseudomonaspalustris.测序结果分析表明该片段是细菌groE基因高保守区 .

ExoCET-BAC策略高效抓取和组装高AT含量基因组大片段

基因克隆是解析基因功能的重要手段,但仍有很多基因难以克隆,比如高AT含量(>60%)基因组来源的DNA。ExoCET克隆技术通过联合核酸外切酶介导的体外同源重组和大肠杆菌RecET重组酶介导的细胞内同源重组,不仅能从微生物基因组中靶向抓取>100 kb的大片段,而且能高效组装>13个DNA片段,是基因克隆的有力工具,迄今未有利用ExoCET技术从AT含量>63%的基因组克隆大片段的报道。本研究以AT含量为69%的海洋单细胞光合蓝细菌原绿球藻MIT 9301菌株的基因组为研究对象,探究了利用ExoCET技术进行高AT含量基因组大片段克隆的最佳条件。结果显示:①在核酸外切酶介导的体外同源重组时使用Gibson体系较T4聚合酶体系能获得更高的克隆效率;②载体应选择单拷贝的细菌人工染色体(BAC),多拷贝质粒载体会导致克隆失败;③ExoCET可以从原绿球藻基因组上抓取>80 kb的大片段,并且能以100%的正确率组装11个3 kb的DNA片段;④可以一步同时抓取4个7~20 kb的基因组大片段。大规模基因组测序显示高AT含量生物占比超过30%,该研究建立的ExoCET-BAC策略将为高AT含量生物的基因组功能研究提供高效使能技术。

高GC含量的鳜鱼rRNA基因家族的克隆

动物rRNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。该研究结合亲缘生物法生物信息学技术,经反复摸索后选用LA PCR法即LA PCR Taq酶结合GC缓冲液来扩增鳜鱼复杂的rRNA基因重复序列,经测序鉴定最终克隆了鳜鱼的3个rRNA基因及其2个间隔序列。分析了鳜鱼与相关动物的rRNA基因序列的同源性和进化关系。探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等措施。

堆肥中微生物总DNA的高效提取

采用化学裂解和酶解相结合的方法,选择加入PVPP的高盐缓冲液作为细胞裂解的反应体系,并以PEG-8000进行DNA沉淀,从高有机含量的堆肥样品中进行微生物总DNA的提取。结果表明,从4种性质不同的堆肥中均获得了高质量的微生物总DNA,所得的DNA分子片段在23kb左右;每克干重堆肥的总DNA提取量为63.54±12.08μg^106.50±28.36μg,A260/A280大于1.6,A260/A230大于1.8,不用经过纯化可以直接进行PCR扩增和限制性酶切;以该DNA为模板进行微生物区系的DGGE分析,显示了丰富的微生物多样性。该方法减少了通常环境样品DNA提取过程中的纯化步骤,减少了DNA的损失,为从事微生物分子生态学,尤其是那些针对高有机含量以及获取极为不易的环境样品的研究而言是十分有益的。

高氟对大鼠口腔粘膜细胞增殖周期和DNA合成的影响

目的 研究高氟对大鼠口腔粘膜细胞增殖周期和DNA合成的影响。方法 雄性SD大鼠饮用含 15 0mg/LNaF的蒸馏水溶液 4周 ,用流式细胞术研究大鼠口腔粘膜细胞增殖周期和DNA相对含量 (DNARC) ,用单细胞凝胶电泳检测DNA损伤。结果 高氟能引起大鼠口腔粘膜细胞增殖周期的改变 ,使G2 /M期细胞明显下降 ,DNARC也显著下降 ,DNA损伤率明显升高。另外 ,高氟也造成口腔粘膜组织的氧化应激 ,活性氧族、脂质过氧化产物显著增高 ,还原型谷胱甘肽明显下降。结论 高氟不仅改变了大鼠口腔粘膜细胞的增殖周期 ,还造成氧化应激 。

高G-C含量突变型Foxo1转基因动物基因型鉴定PCR方法的建立

为解决因目的基因G-C(鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对)含量过高导致的目的基因扩增困难,以及操作过程中多环节引起的DNA污染导致的假阳性问题.本研究以突变型Foxo1(Forkhead转录因子1)转基因小鼠作为对象,就高G-C含量转基因的PCR方法和多个环节避免DNA污染进行了探索,结果显示,实验中消除了PCR的假阴性和假阳性现象,得到了准确的突变型Foxo1转基因小鼠的基因型鉴定结果.

紫茎泽兰高分子量核DNA制备方法的研究

以紫茎泽兰暗培养幼嫩叶片为材料,在细胞核提取缓冲液中加入PVP、抗坏血酸和氨基甲酸钠3种强抗氧化剂,较好地去除了多糖多酚等次生代谢物,经低熔点琼脂糖包埋细胞核及蛋白酶K原位裂解DNA胶块,以获得大分子量DNA;最后分别采用2种不同的限制性内切酶(BamHⅠ和HindⅢ)和5个浓度梯度(0U、0.2U、0.4U、0.6U、0.8U)进行酶切,并对不同的回收方法进行比较分析。结果表明:经脉冲电泳检测,本方法提取的DNA片段长度>600kb,基本无细胞器DNA和蛋白质污染;酶切条件以0.4U酶浓度HindⅢ的效果最好,酶切后的DNA片段主要集中在100～300kb之间,DNA片段大小满足构建BAC文库的要求;对回收方法进行比较分析,电洗脱法回收的大片段DNA浓度远远大于琼脂糖酶切法,大于8mg.L-1,这完全能够满足构建大片段基因组文库对DNA浓度的要求。

孕妇血清HBV—DNA含量与胎儿宫内感染

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全世界共同关注的问题。我国是乙型肝炎的高流行区，人群乙型肝炎表面抗原（HBsAg）携带率高达10％-20％．其中40％-50％通过母婴传播。HBV的围产期传播是重要的传播途径，但是其确切的传播规律和机制至今仍未完全阐明。据统计，

一个具有主效晚抽穗基因的水稻染色体片段代换系的鉴定、形态分析及Ehd4-2定位

抽穗期是决定水稻品种种植地区和季节适应性的重要农艺性状,鉴定抽穗期基因对水稻生产具有重要意义。本研究采用高代回交和SSR标记辅助选择相结合的方法获得了1个以日本晴为受体亲本、西恢18为供体亲本的含有1个控制晚抽穗表型的主效单基因的水稻染色体片段代换系Z315。Z315携带来自西恢18的5个代换片段,分布于第1、第3、第6和第7染色体上,平均代换片段长度为7.39 Mb。Z315的叶绿素含量、株高、穗长、倒一节间长、倒二叶长、倒三叶长、有效穗数、每穗实粒数和总粒数均显著高于受体日本晴,暗示其代换片段可能携带这些性状的QTL。进一步利用日本晴与Z315杂交产生的F1和F2群体对晚抽穗基因进行遗传分析和分子定位。该晚抽穗表型受1对隐性核基因控制,最终将该基因定位于第3染色体RM14283和RM6349之间,物理距离为233 kb。对该区间进行候选基因预测和测序,发现1个与抽穗相关的编码锌指蛋白的基因LOC_Os03g02160在日本晴和Z315间存在差异,该基因可能与Ehd4等位,称作Ehd4-2。由于染色体片段代换系除代换片段外与受体亲本一致,因此本研究无论对进一步分离其他QTL还是进行基因聚合育种均具有较大利用价值。

红曲霉HMW-DNA的制备

用低熔点琼脂糖包埋浓度为1×109～1×1010个/mL红曲霉原生质体液制备得到DNA胶块。经裂解和PMFS纯化后脉冲场电泳检测,胶块中的DNA片段长度在800kb以上,每个胶块DNA含量为8～13μg。DNA胶块经脉冲场电泳去除小于600kb的非目的小片段后用限制性内切酶EcoRI、BamHI、HindIII作用,结果大部分能被酶解。可以用于BAC文库等大片段基因组文库的构建,为红曲霉功能基因组的研究奠定了基础。

高白鲑的细胞遗传学分析

高白鲑（Coregonus peled）属鲑形目（Salmoniformes）、鲑科（Salmonldae）、白鲑属（Coregonus）,为典型冷水性鱼类,最适水温12—15℃,主要分布于北纬50°以北的俄罗斯淡水水域,是俄罗斯的特有经济鱼类。高白鲑适应性强、生长速度快、肉味鲜美、营养价值高,是优良的水产养殖品种。

关于大豆高油育种问题的探讨

大豆的油分含量在20.1%以下时与产量呈正相关趋势,20.1%以上时与产量呈负相关趋势。因此,大豆高油育种具有一定的难度,应广泛搜集、筛选和创造高油中间材料,采用以有性杂交育种为主,结合诱变育种和外源DNA导入等方法进行选育是有效的。

人高亲和力IgE受体α链基因克隆及表达

目的:克隆人高亲和力IgE受体α链基因,并进行原核表达,制备出可溶性FcεRIα蛋白。方法:应用RT-PCR技术,从皮肤组织的总RNA中扩增人高亲和力IgE受体α链基因,连接至PUCm-T载体,重组克隆进行DNA测序。将测序证实的目的片段与高效表达载体pET30a连接,构建重组质粒并转入表达宿主菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化。结果:RT-PCR扩增出一个约950bp的DNA片段,测序结果显示该片段与GenBank上登录的FcεRIα基因序列完全一致;经原核表达后,获得相对分子质量37000的FcεRIα融合蛋白。结论:本实验成功克隆、表达了人FcεRIα基因,制备出可溶性FcεRIα蛋白,为抗FcεRIα抗体的检测及自身免疫性慢性荨麻疹发病机制的研究提供了条件。

应用甜菜碱增加富含三核苷酸重复的高G--C含量DNA片段测序辨识度的最佳浓度探讨

目的通过在Sanger法测序体系中加入浓度梯度的甜菜碱，建立高辨识度的富含三核苷酸重复的高G-C含量DNA片段的测序体系。方法以G-C含量为72％无三核苷酸重复的Nogo-B基因cDNA的5’端序列（the 5’ terminal of Nago—BcDNA，Am-Nogo-B）及G-C含量为74％的富含CAG重复与CCG重复的Huntingtin基因cDNA的5’端序列（the 5’ terminal of huntingtin cDNA，Am-HTT）为例，在Sanger法测序体系中加入浓度梯度的甜菜碱，比较测序结果。结果Am—Nogo—B与Am-HTT基因测序体系中最适宜的甜菜碱浓度相差较大。甜菜碱浓度在0．8～1．2mol／L之间时，Am-Nogo-B测序结果质量最佳。甜菜碱浓度在1．6～2．4mol／L之间时，Am-HTT基因的测序质量最好。结果具有良好的可重复性。结论不同碱基组成类型的高G-C含量DNA片段，即使G-C含量接近，最适宜测序体系中甜菜碱浓度不同。探索出了适宜于增加富含三核苷酸串联重复的高Gc含量DNA片段测序辨识度的体系，可作为类似DNA片段测序的参考方法。