高GC含量的鳜鱼rRNA基因家族的克隆

动物rRNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。该研究结合亲缘生物法生物信息学技术,经反复摸索后选用LA PCR法即LA PCR Taq酶结合GC缓冲液来扩增鳜鱼复杂的rRNA基因重复序列,经测序鉴定最终克隆了鳜鱼的3个rRNA基因及其2个间隔序列。分析了鳜鱼与相关动物的rRNA基因序列的同源性和进化关系。探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等措施。

通过PCR技术简单扩增奶牛高GC含量的rDNA重复序列

为了探索利用PCR简单扩增高GC含量的长重复序列的方法,经反复摸索后选用LAPCR法即LAPCRTaq酶结合GC缓冲液Ⅱ来扩增奶牛高GC含量的长片段重复序列,成功获得了全长2538bp,GC含量为65.7%的DNA序列,其中ITS1的GC含量高达80%.探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用等措施.

PCR重叠延伸法结合分段克隆技术构建高GC含量基因突变载体

目的:构建人类KAP-1基因定点突变载体,为研究该基因的功能奠定基础。方法:综合运用PCR重叠延伸法和分段定向克隆技术。结果:DNA测序结果表明定点突变载体构建成功。结论:成功构建高GC含量(局部高达80.50%),全长为2 500bp的人类KAP-1基因定点突变载体pCMV6-En-try-KAP-1,为全面深入研究KAP-1基因的功能奠定了基础。

高GC含量DNA模板的PCR扩增

目的：探索高GC含量DNA的PCR扩增条件，为扩增达托霉素生物合成基因簇及拼接奠定基础。方法：在PCR扩增体系中，使用高保真的聚合酶及添加不同浓度的DMSO、7-deaza-dGTP等增强剂，并选择合适的PCR循环程序，优化富含GC的DNA的PCR扩增条件。结果：向反应体系中额外添加1%~4%的DMSO可以显著提高富含GC的DNA的PCR扩增产物量，但会降低其特异性；7-deaza-dGTP可以提高扩增产物的特异性及保真度，但产量会有所下降。应用touch down PCR并在体系中添加7-deaza-dGTP能够提高扩增产物的特异性和产率，增加扩增的保真度。结论：应用优化的PCR扩增条件将所有达托霉素生物合成基因簇分段扩增出来，并可扩增出长达6 kb的片段，且序列完全正确，可以进行后续拼接。

高GC含量青枯菌aac基因PCR扩增体系的建立与优化

通过添加增效剂、正交试验设计优化PCR反应体系、联合采用多种PCR程序等措施,建立并优化了PCR扩增体系,成功地从高GC青枯菌基因组中扩增出了长度为2 434 bp且GC含量高达70.9%的aac基因。PCR反应体系为20μL包括5%DMSO2、.5 mmol/L MgCl2、500μmol/L dNTP、10 pmol/L引物1、.25 UTaq酶、50 ng模板DNA。首先采用热启动PCR:95℃5 min,保持80℃,加入Taq酶;然后采用二步PCR:5个循环包括变性95℃1 min,65℃1 min;最后采用降落PCR:30个循环为95℃1 min,78℃1 min,每个循环降低0.5℃,72℃3 min;补充10个循环为95℃1 min,63℃1 min,72℃3 min;72℃10 min。该试验体系的建立与优化为研究高GC含量生物的基因功能提供了方法。

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007高GC基因PCR体系的扩增研究

对生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007基因组上高GC基因PCR扩增体系进行探讨。通过对该菌株基因组进行100℃处理5 min;PCR反应体系为10μL,在体系中使用高保真LA Taq(Mix)酶,并分别加入不同体积分数的DMSO、2×GC bufferⅠ、2×GC bufferⅡ,然后选用适当的PCR程序对产几丁质酶基因(bcc1,GC含量71.1%)进行扩增,在此基础上,选择最适体系对产ACC脱氨酶基因(acd S,GC含量66.86%)、内切葡聚糖酶基因(GC含量74.71%)、色氨酸单加氧酶基因(iaa M,GC含量6.62%)、嗜铁素合成相关基因(cepR,GC含量64.44%)进行PCR扩增,将扩增出的片段与PMD19-T vector连接后转化至大肠杆菌JM-109中进行测序。结果表明:JK-SH007菌株基因组经高温处理后,在PCR反应体系中加入10%DMSO可成功扩增出该菌株bcc1基因(2 484 bp)。该体系同样适用于acd S、内切葡聚糖酶、iaa M、cepR等基因,而且测序结果与预期的序列一致。因此,该体系具有广泛性,而且简单可靠,成本低,扩增效率高,具有很强的实用性,为洋葱伯克霍尔德氏菌群菌株及其他菌株高GC含量基因的克隆提供了参考依据。

高GC hTwist融合蛋白载体构建及其表达条件优化

目的构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist,并转化E.coli DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实:我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化,得到高纯度的融合蛋白。结论上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定基础。

甜菜碱改善水稻高GC含量DNA序列的PCR扩增

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)作为一项基本的分子生物学技术,是DNA序列扩增的强有力工具。水稻作为人类最重要的粮食作物之一被广泛研究,然而由于水稻基因组序列的GC含量相对较高,而高GC含量DNA序列的PCR扩增一般比较困难,使得水稻高GC含量序列的功能研究受阻。通过使用不同的添加剂,发现相比于二甲基亚砜和甘油等,甜菜碱对于水稻高GC含量片段的PCR扩增的增强效果最明显。通过对多个高GC含量的水稻DNA片段进行PCR扩增,发现1-2 mol/L甜菜碱对于增强PCR扩增效果显著。此外,甜菜碱对于多种DNA聚合酶作用下的PCR扩增均有增强效果。

牛Dgat1基因高GC含量片段的定点突变

将扩增出的1.8 kb目的片段克隆入pUCm-T载体,以构建好的质粒为模板进行突变反应。DpnⅠ酶切反应产物,去除甲基化及半甲基化DNA模板。酶切产物经纯化后转入DH5α感受态细胞,提取质粒测序。结果表明,双核苷酸碱基AA突变为GC,成功得到突变载体。将定点突变试剂盒方法加以改进,完成GC含量高达69.5%模板定点突变,改进后的方法操作简单、经济实用,有效地解决了高GC含量模板难突变难题。

高GC含量DNA序列PCR扩增的引物设计

目的建立一种高GC含量DNA序列PCR扩增的引物设计方法。方法共设计了15对高GC含量（66.0%~84.0%）DNA序列PCR扩增引物,引物Tm值均≥79.7℃,引物Tm差值（△Tm）均≤1℃。对本研究所设计引物及相关参考文献中部分引物的参数进行统计学分析。另外,基于本研究方法,设计了26对引物,以验证该方法在非高GC含量（35.2%~53.5%）DNA序列PCR扩增中的实用性。结果采用本研究方法,所有15对高GC含量DNA序列均成功扩增;统计结果显示,Tm值和△Tm是影响高GC含量DNA序列扩增的主要因素。结论设计具有较高Tm值和较低△Tm的引物可有效的解决高GC含量DNA序列的PCR扩增问题。另外,在较高的退火温度下,引物或DNA序列的二级结构无法形成。

高GC含量基因NADK2的扩增及其真核表达载体的构建

在构建线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide kinase,NADK2)真核表达载体时,该文发现,使用Ex Taq DNA聚合酶扩增无法得到其编码区域全长,5′端缺失一段DNA片段。对其cDNA序列进行分析发现,NADK2编码区GC含量不均衡。起始密码子附近GC含量最高可达92.5%,而3′端终止密码子附近GC含量最低只有27.5%。之后,使用LA Taq及GC缓冲液进行扩增,得到了NADK2基因ORF(open reading frame)全长,并克隆入真核表达载体。该文结果对类似高GC含量DNA片段的PCR扩增有一定的提示作用。

载荷对非自耗真空熔炼GC2025高硬刀具的滑动磨损行为的影响

使用的Al2O3对磨材料测试GC2025高硬合金的摩擦性能,并以TC4与9CrSi进行对比,通过实验测试的手段分析载荷对非自耗真空熔炼GC2025高硬刀具的滑动磨损行为的影响。研究结果表明:当载荷由2.5 N提高到20 N的过程中,GC2025高硬合金摩擦系数减小。提高载荷后,GC2025高硬合金以及对比合金均发生了磨损量的线性增大。相比较TC4合金与9CrSi合金,GC2025高硬合金更适合于大载荷环境。以较小的2.5 N载荷进行处理时,在磨痕上形成了平行于滑动方向的犁沟。逐渐增大载荷后,在试样表面形成了更多的附着物,并对犁沟造成更大范围的被覆。提高载荷后,磨屑内形成了5μm尺寸的不规则剥落物。处于2.5-10 N的载荷区间中,GC2025高硬合金磨痕深度线性增长;当载荷继续从10 N提高到20 N时,表面形成的磨痕深度保持基本恒定的状态。相对于TC4,GC2025高硬合金达到了更小的磨损率。

小麦种子过氧化物酶基因wp1的克隆及在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆小麦种子过氧化物酶基因wp1,并利用原核系统表达纯化。【方法】通过RT-PCR从小麦未成熟种子中扩增wp1基因cDNA,构建His-tag和MBP融合表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。使用直链淀粉亲和层析获得MBP-WP1融合蛋白,并以ABTS为底物检测酶活性。【结果】获得的wp1基因cDNA编码一种358个氨基酸残基的蛋白产物,其序列与大麦BP1相似性高达89%;空间结构预测结果表明,小麦WP1属于第三类过氧化物酶,具有该家族成员典型的血红素和钙离子结合位点;His-Tag融合的WP1主要以包涵体形式存在,而MBP融合的WP1主要以可溶形式存在,表达量分别达到总蛋白的18.2%和34.6%;纯化获得的MBP-WP1融合蛋白可检测到过氧化物酶活性。【结论】使用原核系统可高效表达出可溶性的、具有部分活性的WP1蛋白。

改进重叠延伸法引入DNA定点突变的新方法

目的:改进重叠延伸PCR法,实现一种引入DNA定点突变的准确简便方法。方法:通过应用不同的扩增酶和反应体系,以重叠延伸PCR的方法产生引入突变位点的DNA片断,然后再亚克隆到载体中。该文以人cyclin D1启动子的NF-κB位点(-39/-30)为例。结果:通过DNA测序证明定点突变成功引入。一次引入4个突变碱基。突变引入率为100%。

朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶cDNA 5′末端序列的克隆及植物表达载体的构建

采用改良的RT-PCR及5′RACE法,成功地克隆了朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA 5′端序列,与已知序列拼接,获得了BADHcDNA全长1781bp,包含一个完整的开放阅读框(ORF),编码506个氨基酸。其含有醛脱氢酶高度保守序列VT/SLELGGKSP,及其后29位与酶功能有关的Cys。多序列比对和系统进化分析表明,朝鲜碱茅BADH与大麦BBD1同源性最高,并构建了PBI121-BADH植物表达载体。

应用复合增强剂扩增人巨细胞病毒pp65全基因

在PCR过程中 ,模板GC含量过高是一个不利因素。如果设计扩增片段较长 ,则进一步增加了PCR扩增的难度。解决这一问题对于以PCR成功获取富含GC的长基因有非常重要的意义。以人巨细胞病毒pp65全基因 (约 1 95 0bp ,GC %为 67%)为例 ,在PCR系统中测试不同添加剂(甘油、乙醇、DMSO、甜菜碱等 )及各种组合 ,摸索扩增目的基因的最佳条件。结果发现 :无或单一的添加剂都不能获得目的基因片段 ,只有当同时使用DMSO和甜菜碱 ,并在适当浓度时才能够获得特异产物。在PCR系统中包含复合增强剂能有助于高GC %、长基因片段的扩增 。

巢式PCR-RFLP法检测Cystatin C基因多态性的实验研究

目的建立检测高GC含量的CST3基因多态性的巢式PCR-RFLP方法.方法以巢氏PCR方法扩增CST3基因5′端和外显子1的特异性片段,用RFLP方法分析该基因的多态性.结果应用Enhancer System,以巢氏PCR方法能高效扩增出高GC含量的CST3基因5′端和外显子1区的特异性片段,用SacⅡ限制性酶切对CST3基因多态性进行有效分析.结论该方法能准确、高效的对CST3基因多态性进行分析,研究结果对高GC含量基因的研究有借鉴价值.

水环境中EDC与POPs检测技术进展与要点分析

介绍了水环境中环境激素和持久性有机物的检测技术发展现状和检测中运用的重要技术手段,包括高分辩气相色谱/质谱联用或多重质谱(HSGC/MS/MS)、柱后衍生、大体积富集浓缩、固相萃取、净化柱等,并对他们的应用要点进行分析,以利环境研究工作者参考和借鉴。

北京犬ITS-2 rDNA的PCR扩增、克隆及分析

本研究以从中国广东深圳某动物医院采集的北京犬血液样品为研究对象,经反复摸索,选用LATaq酶结合降落PCR方法,成功地扩增出北京犬的核糖体基因组(rDNA)的第2内转录间隔区(ITS-2)序列。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-TEasy载体,用PCR技术及酶切鉴定阳性菌落,对阳性菌落质粒DNA进行测序。结果表明,ITS-2片段大小为1138bp,GC含量为83.57%。本研究为犬线粒体等真核生物高GC含量序列的有效扩增作了有益的探索。