17β-HSD14 基因在魁蚶性腺发育过程中的表达特征

为探究性类固醇激素合成相关基因17β-羟类固醇脱氢酶14(17β-hydroxysteroid dehydrogenase 14,17β-HSD14)在魁蚶(Scapharca broughtonii)性腺发育过程中的作用,本研究从魁蚶转录组中筛选并验证了17β-HSD14基因序列,通过原位杂交和实时荧光定量PCR检测了该基因在魁蚶中的组织定位及性腺发育过程中表达变化规律。结果显示:17β-HSD14基因的编码区序列长度为822 bp,编码273个氨基酸;原位杂交实验在魁蚶卵巢的成熟卵细胞、滤泡壁和精巢中的精原细胞、精子以及其他组织的细胞中都检测到了17β-HSD14基因的阳性杂交信号;qRT-PCR结果表明,17β-HSD14基因的表达随其性腺发育而产生变化,在形成期(Ⅰ期)到增殖期(Ⅱ期)的过程中呈上升趋势,成熟期(Ⅲ期)至耗尽期(Ⅴ期)呈下降趋势,且在卵巢组织中的表达量显著高于精巢组织。综上,17β-HSD14基因与魁蚶的性腺发育密切相关,可能对其性腺发育、功能维持和成熟具有重要的作用。

魁蚶3个群体及杂交子代遗传多样性分析

为探明魁蚶不同群体间遗传多样性差异,以魁蚶中国群体、韩国群体和杂交子一代群体为研究对象,利用线粒体基因(16S rRNA和COⅠ)和核糖体内部转录间隔区(ITS-1)对5个魁蚶群体共150个样本进行遗传多样性分析。结果显示,魁蚶16S rRNA、COⅠ和ITS-1同源序列片段长度分别为605、766 bp和419 bp,其中16S rRNA和COⅠ基因片段A+T含量均高于G+C含量,ITS-1片段A+T含量均低于G+C含量。16S rRNA和COⅠ基因分别定义了4个和14个单倍型,主体单倍型所占频率分别为81.58%和61.43%,ITS-1定义了24种单倍型,主体单倍型所占频率为50.67%。单倍型邻接关系树结果显示,16S rRNA和COⅠ基因均为4个子一代群体聚为1支,即墨群体独有的单倍型为1支,而ITS-1的分支无明显群体特征。16S rRNA和COⅠ的遗传分化结果均表明,即墨群体与其他4个群体间遗传分化较大,其他4个群体间不存在分化;ITS-1的结果显示,5个群体间的遗传分化指数值均小于0.25,遗传分化不明显。试验结果表明,在进行魁蚶种内遗传进化研究时,线粒体基因的敏感性高于核糖体基因,即墨群体的遗传多样性明显高于4个子一代群体。

牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩增检测方法的建立及初步应用

为建立牡蛎疱疹病毒魁蚶株快速、灵敏、准确和操作简便的检测方法,实验根据已测序完成的Os HV-1-SB全基因组序列,选择其保守区域,建立了交叉引物等温扩增检测方法,并对反应温度、d NTPs、Mg2+浓度和反应时间进行了优化。结果显示,最佳温度为63℃,反应时间为60 min,d NTPs浓度为1.4 mmol/L,Mg2+浓度为6 mmol/L。该方法检测灵敏度为30拷贝的质粒DNA,并且特异性较强,与贝类常见病原急性病毒性坏死病毒、鲍鱼疱疹病毒、派琴虫、包纳米虫、马尔泰虫以及对虾白斑综合征病毒和副溶血弧菌均无交叉反应。使用实验建立的CPA检测方法对2012年分别采自韩国庆尚南道、山东长岛、辽宁大连共计22份Os HV-1-SB感染情况未知的魁蚶样品进行了检测。研究表明,实验所建立的Os HV-1-SB的CPA检测方法简单、快速、灵敏且特异性强。由于其检测结果可通过简单离心或者向反应管中加入核酸荧光染料Gene FinderTM进行肉眼观察,所以可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用,具有较好的应用前景。

海湾扇贝、刺参、魁蚶间作立体混养模式试验

为充分利用水体空间,降低养殖成本,在海洋牧场海域进行了海湾扇贝(Argopecten irradians)、刺参(Stichopus japonicus)、魁蚶(Scapharca broughtonii)间作立体混养试验,形成由不同营养级生物组成的综合养殖系统。苗种增殖后对试验海域和非试验海域进行了水质监测,结果显示,苗种增殖对试验海域没有造成污染,而三个水产品种的滤食特性对水质有一定的改善。统计三个水产品种收获情况,海湾扇贝、刺参和魁蚶产量分别为11000 kg/hm^(2)、767.59 kg/hm^(2)和1302 kg/hm^(2)。试验证明,海湾扇贝、刺参、魁蚶间作立体混养模式不仅具有较好的生态效益,同时具有显著的经济效益。

魁蚶核糖体DNA基因转录间隔区的序列特征

以相应引物PCR扩增魁蚶(Scapharcabroughtonii)的核糖体转录间隔子ITS 1和ITS 2片段,测序后得到长度分别为461bp和533bp的核苷酸序列(含引物)。其中A、T、G、C4种碱基的含量分别为21 91%、24 73%、28 20%和25 16%(ITS 1),27 02%、25 52%、25 52%和21 95%(ITS 2)。将这2个片段与其他双壳贝类的相应片段进行比较,发现ITS 1和ITS 2引物在贝类中具有良好的通用性。比较几种贝类的ITS 1片段发现有1～100bp长度不等、弥散状态的插入/缺失;对5种蚶科贝类的ITS 2相应片段进行比较,发现中间有75bp的保守区域,与本研究在魁蚶ITS 2群体序列研究中观察到的情况相同。

魁蚶线粒体16S rRNA和COI基因片段序列测定及其应用前景

Mitochondrial gene(16S rRNA and COI) fragments of Bloody clam Scapharca broughtonii were amplified via PCR, the PCR products were ligated into T vectors, cloned and sequenced. 823 bp and 703 bp nucleotide sequences of partial 16S rRNA gene and partial COI gene were obtained respectively. The contents of A, T, G and C were 24.79%,23.57%,29.16% and 22.48% in 16S rDNA; 22.05%,33.85%,23.33% and 20.77% in COI. The potential uses of these two sequences were discussed for genetic variation, differentiation and relevant research of different geographic populations in the species.

山东近海魁蚶资源增殖的研究

报道了一种海洋贝类─—魁蚶资源增殖研究的全过程，包括人工育苗、中间培育、底播放流以及增殖生物学等．结果表明，对亲贝采用阴干、流水、升温、精液或漂白液刺激等诱导方法，苗种生产可实现全工厂化；风浪小、饵料丰富的内湾、虾池等是稚贝适宜的中间培育水域．当年稚贝主要生长期为７—１１月，略高于成体适温上限的环境更利于生长，但越冬（１２—２月）后的稚贝难以渡过２６℃以上的高温；选择敌害生物少、海底表面稳定性好的海区是增殖成败的关键．放流苗种的理想规格为２．０—２．５ｃｍ，１年后回捕率在５０％以上，１．５年后可达壳长５ｃｍ以上的商品规格，增殖效果显著．

魁蚶两个不同群体形态性状对体质量的影响效果分析

随机选取中国江苏与韩国通营两个不同地理群体魁蚶,分别测量壳长(X1)、壳高(X2)、壳宽(X3)、壳顶宽(X4)、外韧带长(X5)、背缘长(X6)和放射肋宽(X7)等7个形态性状指标并称量活体重(Y),采用多元分析方法分析了各形态性状对体质量的影响效果。结果表明,两群体魁蚶各形态性状对体重的影响效果不同。江苏魁蚶各性状相关性都达到极显著水平,壳长、壳高和壳宽对体重的直接影响和辅助其他性状的间接影响作用较大;通营魁蚶各性状相关性没有全部达到极显著水平,壳长对体重的直接影响和辅助其他各性状间接影响体重的作用最大。经显著性分析,将偏回归系数显著的变量对体质量建立多元回归方程,分别为:江苏魁蚶Y=-77.05+1.366X1+1.306X3;通营魁蚶Y=-108.22+1.979X1+0.964X2,两方程的回归系数均达到极显著水平。

青岛魁蚶软体部营养成分分析及评价

对青岛魁蚶软体部的营养成分进行了分析,并对其营养品质进行了评价。结果表明,魁蚶软体部干样中,粗蛋白、粗脂肪、总糖和灰分的质量分数分别为72.67%、1.23%、4.44%和11.73%;软体部含有18种氨基酸,总量为719.75mg/g(干重),其中8种必需氨基酸(EAA)总量是251.23mg/g,占氨基酸总量的34.91%,其必需氨基酸的构成比例符合FAO/WHO的标准。魁蚶软体部各必需氨基酸平均得分为107.86分,第一限制性氨基酸为缬氨酸,第二限制性氨基酸为色氨酸;魁蚶软体部脂肪酸中ω-3PUFA质量分数为33.32%;含有丰富的水溶性维生素VC、VB2、VB3和VB5,并富含钙、铁、锌、硒等多种无机元素。魁蚶中重金属含量极低,无重金属污染和六六六、滴滴涕残留,食用安全性高。研究认为,魁蚶是一种高蛋白、低脂肪、氨基酸含量丰富且均衡,营养价值较高的贝类。

4个地理群体魁蚶(Scapharca broughtonii)的形态差异与判别分析

运用多变量形态度量学分析方法对韩国统营、山东黄岛、山东蓬莱、江苏前三岛4个地理区域的魁蚶(Scapharca broughtonii Schrenck)种群间的形态变异进行了研究。单因素方差分析(ANOVA)和Tukey检验表明,魁蚶不同地理种群表现出显著形态变异(P<0.05)。聚类分析结果表明,黄岛和前三岛两个种群形态最为接近,首先聚为一类,然后与韩国种群聚类,再与蓬莱种群聚类;主成分分析构建了3个主成分,其贡献率PC1为33.366%,PC2为20.407%,PC3为15.422%,3个主成分累计方差贡献率为69.195%;建立了魁蚶4个种群的判别函数,其判别准确率分别为韩国通营96.4%,山东蓬莱100%,山东黄岛84.3%,江苏前三岛95.6%。这些数据可为魁蚶不同地理种群的识别、种质资源的可持续利用及保护提供依据。

海水中某些化学因子对魁蚶幼虫、稚贝及成体的影响

本文报道了S‰,NH_3-N,pH及O_2对魁蚶幼虫、稚贝及成体影响的初步研究结果,求得魁蚶幼虫、稚贝及成体对S‰,NH_3-N,pH和O_2的适应浓度范围和最适范围。结果表明:魁蚶随年龄的增长,对S‰的适应能力逐渐减弱;对NH_3-N,pH及O_2的适应能力则逐渐增强。

不同饵料和饥饿对魁蚶幼虫生长和存活的影响

在水温23.2—24.0℃,盐度29.5—30.0条件下,研究了5种单胞藻饵料和饥饿对魁蚶浮游幼虫生长与存活的影响。投喂不同饵料试验中,球等鞭金藻与4种单胞藻混合投喂试验组幼虫的特定生长率、眼点幼虫比例和壳长均显著高于单一投喂试验组,其中球等鞭金藻与小球藻混合投喂的效果最好;投喂单一饵料试验中,球等鞭金藻组幼虫的生长、眼点幼虫比例与存活率显著高于其它试验组。在饥饿试验中,不同饥饿天数条件下幼虫的存活率差异不显著;生长方面,饥饿1—2d较短时间与一直投喂对照组的幼虫相比较,特定生长率、眼点幼虫比例、壳长的差异不显著,但随着饥饿时间延长,幼虫的生长变慢且眼点幼虫比例下降,一直饥饿情况下幼虫的生长基本停滞。研究结果可以为魁蚶人工苗种繁育技术的改进提供参考依据。

魁蚶苗种的潜沙行为观察

根据魁蚶苗种的壳长将其分为6组:0.50 cm组、1.00 cm组、1.50 cm组、2.00 cm组、2.50 cm组、3.00 cm组,在实验室条件下,对不同规格魁蚶Scapharca broughtonii苗种的潜沙行为及潜沙能力进行了观察。结果表明:魁蚶潜沙行为分为准备期、潜沙期及结束期,其中潜沙期主要包括伸出斧足、竖壳、潜沙3个主要动作;不同规格的魁蚶苗种,其潜沙能力差异明显。壳长为0.50 cm的组,潜沙准备时间(8.5 min)、潜沙时间最长(24 min),潜沙率最低(10%);壳长为1.50～3.00 cm时,魁蚶的潜沙准备时间和潜沙时间明显缩短,潜沙率提升至90%以上;壳长为1.50 cm组的魁蚶完成潜沙的时间最短,在10min之内能够完成潜沙过程。

盐度胁迫对魁蚶稚贝血淋巴渗透压及鳃Na^+/K^+-ATP酶活力的影响

文章研究了盐度胁迫下魁蚶(Anadara broughtonii)稚贝(壳长25~35 mm)血淋巴渗透压和鳃Na+/K+-ATP酶活力的变化。结果显示,突变胁迫下,盐度20、25、35、40组的稚贝血淋巴渗透压均在48 h内显著降低或波动升高后趋于稳定,盐度15组则需96 h完成波动调整。以日变幅5渐变至高盐40过程中,稚贝血淋巴渗透压在48 h内趋于稳定;低盐15组仅需72 h完成渗透压调节,调整时间显著小于突变组。盐度突降胁迫下,各处理组稚贝鳃Na+/K+-ATP酶活力12 h后显著升高,24 h分别达到最大值,随后快速回落并稳定在高于对照组水平;盐度骤升胁迫下,鳃ATP酶活力波动降低,在12~24 h达到最小值后稳定在低于对照组水平。低盐(15)和高盐(40)渐变组的鳃ATP酶活力变幅均小于突变组。盐度胁迫下鳃Na+/K+-ATP酶活力的响应方式不同,即低盐胁迫时活力增强,高盐胁迫时活力降低。采用盐度渐变的驯化处理更有利于魁蚶稚贝应对盐度胁迫。

魁蚶血细胞分类及其免疫功能的初步分析

借助显微观察和鳗弧菌免疫刺激等手段,首次对魁蚶血细胞进行分类及免疫功能分析。魁蚶血细胞可分为3大类:红细胞、白细胞和血栓细胞,红细胞发育过程大致经历新生、成熟、衰老和死亡4个阶段。白细胞分为:嗜酸性、嗜中性、嗜碱性细胞,以及淋巴细胞和巨核细胞。嗜酸性、嗜中性、嗜碱性细胞和血栓细胞均参与血液的凝固;红细胞、白细胞均有吞噬病原菌能力,红细胞具有被动吞噬作用和免疫吸附作用,白细胞具有主动吞噬作用,嗜酸性和嗜中性细胞是吞噬病原菌的主体,嗜碱性细胞具有吞噬大颗粒异物的作用,魁蚶感染病原菌后白细胞增多并表现炎症。研究表明,魁蚶血细胞在应对外界的免疫刺激时,能作出系统免疫应答,且血细胞免疫分工明确,以抵御外界不良刺激。

不同地理群体魁蚶的营养成分比较研究

分析和评价山东即墨、辽宁庄河、江苏连云港3个不同地理群体魁蚶的营养成分。用常规方法检测魁蚶软体部的一般营养成分,用氨基酸分析仪检测氨基酸组成;用气相色谱法检测脂肪酸成分。结果表明:蛋白质含量和能值以江苏连云港群体最高;碳水化合物以辽宁庄河群体最高;氨基酸的组成非常全面,各地理群体魁蚶干物质中氨基酸总量由高到低的变化顺序为山东即墨(719.75mg/g)>江苏连云港(703.54mg/g)>辽宁庄河(685.16mg/g);EAA/TAA比率在34.72%～34.91%之间,必需氨基酸指数IEAA以山东即墨群体最高;呈味氨基酸的含量较高,变化范围为276.92～293.21mg/g;脂肪酸中ω3脂肪酸相对含量高;钙、铁、锌、硒等矿物元素和维生素含量丰富。不同地理群体的魁蚶营养成分虽存在一定差异,但与其他一些双壳贝类相比,魁蚶是营养价值较高的海洋食品。

温度对魁蚶稚贝潜沙能力及对多棘海盘车捕食魁蚶稚贝能力的影响

在实验室条件下,研究了温度变化（10、15、20、25和30℃）对魁蚶稚贝（壳长2～3 cm）潜沙能力,及多棘海盘车对魁蚶稚贝捕食速率的影响。结果发现,水温10℃时,魁蚶稚贝的初次潜沙时间（初潜时间）最长,潜沙率最低,分别为28.87 min、21.25%,且与其他温度处理组差异显著（P〈0.05）。20℃时,魁蚶稚贝初潜时间最短、潜沙率最高,分别为7.49 min、55.63%,可视为魁蚶稚贝的最适潜沙温度。多棘海盘车对魁蚶稚贝的捕食速率受温度影响显著,水温20℃时捕食速率最大,为5.28个/d,且与10℃、25℃处理组间存在明显差异（P〈0.05）。水温15～20℃时,多棘海盘车的捕食温度系数Q10为2.22,可视为其最适捕食温度。魁蚶稚贝的最适潜沙温度与多棘海盘车的最适捕食温度范围重叠。因此,在水温20℃左右进行魁蚶稚贝底播增殖时,也是多棘海盘车捕食速率的最高时期,应加强底播海区多棘海盘车的清除。

基于SSR标记的魁蚶(Scapharcabroughtonii)不同群体遗传结构的分析

运用6对微卫星分子标记分析了山东蓬莱(SP)、山东黄岛(SH)、江苏前三岛(JQ)、韩国统营(Korea)等魁蚶4个地理群体的遗传结构。结果表明,4个魁蚶群体在6个位点的等位基因数(a)为11.3333—14.3333,平均有效等位基因数(ae)为6.2977—9.5873;平均杂合度观察值(Ho)为0.4083—0.5641,平均杂合度期望值(He)0.7849—0.8753,各位点平均多态信息含量(PIC)值为0.7703—0.9102,遗传多样性非常丰富。聚类分析结果表明黄岛群体与前三岛群体聚在一起,蓬莱群体与统营群体聚在一起最后聚类。本研究结果可为今后魁蚶种质资源保护和遗传育种提供遗传学资料。

温度对魁蚶能量代谢及抗氧化酶活性的影响

采用实验生态学方法,研究了魁蚶能量代谢及抗氧化酶活性对不同温度水平(20、23、26和29°C)的响应。结果显示,魁蚶的摄食率和排粪率都随着温度的升高而降低,单因素方差分析表明,温度显著影响魁蚶摄食率,而对排粪率的影响不显著。魁蚶耗氧率和排氨率随温度的升高呈先增高后降低的趋势,均显著受温度影响。通过建立能量收支方程,发现温度影响魁蚶的能量分配,20°C魁蚶呼吸能占13.71%、排泄能占1.89%、排粪能占22.94%、生长能占61.47%,但是超过20°C,摄食能显著减少,生长余力甚至出现负值。方差分析表明,温度对魁蚶的摄食能和生长余力均具有显著影响。魁蚶外套膜、鳃和肝胰腺的抗氧化酶活性分别在实验开始后的0、4、8、12、24、48和72 h取样检测,在20～29°C,魁蚶体内的T-AOC呈先升高后降低的趋势,且29°C温度下的T-AOC均低于其他温度组。短期内的高温刺激能够促使SOD和CAT活性升高,但超过24 h其组织中的SOD和CAT活性降低,其中鳃和肝胰腺的SOD和CAT活性受温度影响显著,而外套膜受温度影响不显著。GST活性在4～12 h内随着温度升高而显著升高,而在24 h后,尤其当温度升至29°C时,GST活性显著下降。本研究推测,高温对魁蚶的能量代谢及免疫能力造成严重的影响,导致机体抗氧化能力下降,这可能是夏季魁蚶死亡率较高的一个重要原因。研究表明,魁蚶的适宜温度狭窄,建议在魁蚶养殖生产中,水温应低于23°C,超过26°C会导致机体大量的能量消耗。

魁蚶(Scapharca broughtonii)半乳糖凝集素(SbGal)基因cDNA的克隆及表达分析

半乳糖凝集素(Galectin)作为动物凝集素家族的一员,是一种重要的免疫因子,在脊椎动物和无脊椎动物中都参与了重要的免疫防御反应。为明确魁蚶(Scapharca broughtonii)半乳糖凝集素基因的结构特征、组织分布及其对病原菌刺激的免疫反应规律,本研究从构建的魁蚶转录组文库中筛选得到半乳糖凝集素基因部分序列,通过c DNA末端快速扩增(rapid amplication of c DNA ends,RACE)技术获得该基因c DNA全长序列(命名为Sb Gal)。序列和结构分析表明,该c DNA全长3120bp,编码554个氨基酸,是一个含有4个糖识别结构域(CRD)的且在双壳贝类中较为独特的半乳糖凝集素;预测蛋白的分子量(Mw)为63.3158 k Da,理论等电点(p I)为4.99。同源性及系统分析表明,Sb Gal基因与美洲牡蛎、合浦珠母贝、海湾扇贝galectin的同源性分别为70%、65%、46%,Sb Gal基因四个CRD彼此的相似性为36%—41%。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)结果表明:Sb Gal m RNA在魁蚶血细胞、斧足、闭壳肌、外套膜、鳃和肝胰腺中均有表达,血细胞中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低;注射鳗弧菌后,相对于对照组,Sb Gal基因在所检测的每个组织中m RNA水平上的表达量都显著上调(P<0.01),而且表达量具有显著的时间依赖性和瞬时表达趋势,呈现先升高后降低的趋势。