昆虫鱼尼丁受体结构功能及抗性机制研究进展

双酰胺类杀虫剂可用于控制包括鳞翅目、鞘翅目等在内的多种重要农业害虫,作用机制新颖且对非靶标生物安全低毒,已成为目前全世界销量最高的杀虫剂品种之一。近期在抗性昆虫种群里发现的突变大幅降低了其效能,对各国的农业生产造成了巨大的经济损失。双酰胺类杀虫剂的分子靶标鱼尼丁受体作为近年来最受关注的新型热点靶标被广泛研究。本文总结了昆虫鱼尼丁受体结构和功能研究方面的最新发现,包括1)双酰胺类杀虫剂在昆虫鱼尼丁受体上的结合位点和作用方式;2)抗性突变对靶标结构功能的影响;3)双酰胺类杀虫剂结合位点以外的潜在新作用位点;4)传统和新作用位点在靶标和非靶标生物鱼尼丁受体上的结构差异,并对基于鱼尼丁受体结构的新一代绿色杀虫剂设计开发进行了展望。

鱼尼丁受体及以其为靶标的杀虫剂

作为最大的离子通道受体蛋白,鱼尼丁受体(Ry R)主要介导生物体胞内钙离子(Ca^(2+))释放而对肌肉兴奋-收缩耦联等生命活动起关键作用。由于在昆虫和脊椎动物体内存在显著差异,Ry R成为现代杀虫剂研发的理想靶标。由此开发的以氟苯虫酰胺和氯虫苯甲酰胺为代表的双酰胺类杀虫剂也成为最重要的杀虫剂品类之一。对Ry R及其Ca^(2+)释放通道的结构和功能进行介绍,并对以Ry R为靶标的杀虫剂(主要是双酰胺类杀虫剂)的研发背景与现状、化学合成、作用机制、生物活性、安全性、抗性、制剂及应用等进行总结,旨在为该类杀虫剂的研究、开发和应用提供指导。

昆虫鱼尼丁受体及以其为靶标的杀虫剂的研究进展

植物保护领域以昆虫鱼尼丁受体(ryanodine receptor,RyR)为靶标的杀虫剂的研发取得了突破性进展。对近年来RyR在分子结构、功能调节,以及对以RyR为靶标的杀虫剂的作用机制方面的研究进展进行了综述。昆虫RyR与哺乳动物RyR仅有约47%的同源性,因而是一个有效的杀虫剂靶标。昆虫RyR克隆与表达技术的成熟为新型杀虫剂的开发和作用机制的研究提供了有力的工具。昆虫RyR单通道、配体结合和免疫学特性的研究补充了RyR的电生理学数据。近年来开发的新型RyR杀虫剂通过激活害虫鱼尼丁敏感的细胞内钙离子释放通道来达到杀虫的效果。

氯虫苯甲酰胺对小菜蛾鱼尼丁受体基因mRNA表达量的影响

采用实时荧光定量PCR研究比较了氯虫苯甲酰胺、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和溴虫腈对小菜蛾鱼尼丁受体基因mRNA表达量的影响,研究分析了低剂量氯虫苯甲酰胺连续处理和间断处理对小菜蛾鱼尼丁受体基因表达量的影响,以及对氯虫苯甲酰胺产生抗性的小菜蛾与敏感小菜蛾鱼尼丁受体基因表达量的差异。结果表明:氯虫苯甲酰胺可提高小菜蛾鱼尼丁受体基因表达量,而甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和溴虫腈对其表达量均无影响;0.05和0.01 mg/L的氯虫苯甲酰胺均可使小菜蛾鱼尼丁受体基因表达量增加;对氯虫苯甲酰胺产生抗性的小菜蛾鱼尼丁受体基因表达量是敏感小菜蛾的5.79倍。研究结果有助于阐明氯虫苯甲酰胺的作用机理,并可能为筛选作用于鱼尼丁受体的新化合物提供参考。

桃小食心虫鱼尼丁受体基因克隆及表达模式分析

【目的】二酰胺类杀虫剂的作用靶标鱼尼丁受体(ryanodine receptor,Ry R)是目前所知的最大的离子通道蛋白,该受体可控制细胞内Ca2+的释放,对细胞内Ca2+的稳定起着关键作用。克隆获得桃小食心虫鱼尼丁受体基因(Cs Ry R)全长序列,进一步解析该基因在桃小食心虫(Carposina sasakii)各发育阶段的表达模式。【方法】通过同源序列比对的方法,利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)获得该基因的全长c DNA序列;应用生物信息学软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、功能结构域等信息进行预测分析,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,明确其系统进化关系。分别提取桃小食心虫各发育阶段RNA,以GAPDH为内参基因,应用RT-q PCR技术,解析Cs Ry R在桃小食心虫各发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)的表达模式。【结果】桃小食心虫Cs Ry R的c DNA全序列长度为15 766 bp,开放阅读框15 405 bp,编码5 134个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示,Cs Ry R与脊椎动物Ry Rs的一致度分别为45%—47%;与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)Ry R的一致度也为46%。在昆虫Ry Rs中,与鳞翅目一致度为91%—94%,与同翅目、双翅目昆虫一致度均为79%。系统发育树显示该基因编码的蛋白质与鳞翅目夜蛾科和螟蛾科害虫Ry Rs亲缘关系最近。结构域分析结果显示,Cs Ry R具有Ry R的典型结构域,如位于C-末端的6个跨膜结构域(AA 4 467-5 029)、释放Ca2+的通道形成基序GVRAGGGIGD、Ca2+结合位点EF-hand和3个ATP结合位点GXGXXG等。二酰胺类杀虫剂可能的作用位点AA 183-290(Bm Ry R),AA 4 610-4 655(Dm Ry R)和4 946G(Px Ry R)在Cs Ry R中无特殊性。此外,Cs Ry R中存在AA 2 490-2 496 TQAPRPG和5 131-5 134 SQAK两个基序,在其他物种中均没有发现。RT-q PCR分析结果表明,Cs Ry R在蛹期表达量最高,分别是1日龄卵、6日龄卵、初孵幼虫、老熟幼虫和成虫的25.19、7.73、6.48、4.74和3.58倍。【结论】克隆了Cs Ry R基因全长c DNA序列,证明其表达具有发育阶段特异性。

以昆虫鱼尼丁受体为靶标的化合物活性筛选方法研究进展

昆虫鱼尼丁受体(ryanodine receptor,RyR)是目前新型杀虫剂创制中备受关注的靶标之一。在以RyR为靶标的杀虫剂氟虫酰胺和氯虫酰胺商品化后,大量基于该靶标的新型化合物被设计并合成出来。为加速研发和快速准确筛选以昆虫RyR为靶标的药剂,主要以氟虫酰胺和氯虫酰胺的活性筛选研究为例,对作用于RyR化合物的各种活体筛选方法和离体筛选方法进行了综述。其中活体筛选方法主要包括:点滴法、浸叶法、浸卵法、浸虫法、注射法和喷雾法;离体筛选方法主要包括MTT法、膜片钳技术、荧光技术、膜片钳技术与荧光技术结合以及计算机模拟筛选。通过对各种方法的分析比较,认为离体筛选方法快速、准确,在新型RyR杀虫剂活性的筛选研究中将进一步得到应用。

新型二酰胺类杀虫剂对鱼尼丁受体作用的分子机理

最近发现了一类新型二酰胺类杀虫剂——氟虫酰胺和氯虫酰胺,其作用靶标是鱼尼丁受体(ryanodine receptors,RyRs)。本文对RyR的结构与功能、电压门控钙离子通道和鱼尼丁受体钙离子释放通道对细胞质钙离子内环境稳定的调节以及二酰胺类杀虫剂对RyRs作用的分子机理进行综述。二酰胺类杀虫剂使昆虫RyR通道处于持续的开放状态,引发钙离子从肌质网腔内大量释放,破坏了细胞质钙离子内环境的稳定,从而产生不同的药物学特性。这些变化都是由一个不同于鱼尼丁在RyR上的结合部位介导的。该类杀虫剂的作用对昆虫RyRs是高度专一的,结果产生选择毒性。由于二酰胺类杀虫剂的结构独特,作用方式新颖,对鳞翅目害虫效果好、杀虫谱广,对各种益虫和天敌安全,并对现用的杀虫剂无交互抗性,故它们非常适合于抗性治理和IPM。

鱼尼丁受体类杀虫剂的研究进展

介绍了鱼尼丁受体类新型杀虫剂的创制现状、作用机制、生物活性、毒性及合成方法,由于此类杀虫剂的结构独特、作用方式新颖、对鳞翅目害虫效果好、杀虫广谱,该类药剂对各种益虫和天敌安全,对现用的杀虫剂无交互抗性,具有良好的发展前景.

鱼尼丁受体及以其为靶标的杀虫剂

以鱼尼丁受体为靶标的双酰胺类杀虫剂由于其较强的杀虫活性和对哺乳动物安全而成为农药研究创制单位关注的热点。对近些年来在鱼尼丁受体的同工型、高级结构、门控特性及以鱼尼丁受体为靶标药剂毒理学等方面的研究进行了综述,总结了双酰胺类杀虫剂代表药剂氯虫苯甲酰胺对昆虫的致死效应以及对昆虫生长发育、生殖、取食行为等方面的影响。

小菜蛾鱼尼丁受体基因克隆及序列分析

利用RT-PCR和RACE技术克隆了小菜蛾(Plutella xylostella)鱼尼丁受体(Px-RyR)基因,其核苷酸序列全长15 748bp,5′非编码区267bp,3′端非编码区109bp,开放阅读区全长为15 372bp(GenBank登录号:JF927788),编码5 123个氨基酸残基。估测其蛋白分子量为579.39ku,等电点为5.45。该基因编码氨基酸序列和其他鳞翅目昆虫RyR氨基酸序列比对相似性较高(92%),与哺乳动物3种亚型RyRs的相似性为45%～47%。此外,二级结构预测,其C-末端存在6个跨膜区域;且Px-RyR中存在一个出现4次重复,长度为89～95个氨基酸的RyR结构域,平均相似性为33%。

鱼尼丁受体抑制剂及其作用机制研究进展

近年来,以鱼尼丁受体(ryanodine receptor,Ry R)为靶标的杀虫剂研发取得了突破性进展。介绍了Ry R结构和功能,以及Ry R为靶标的杀虫剂的创制历程,作用机制的研究进展。该类杀虫剂靶标新颖,作用机理独特、高效,对非靶标生物安全(如哺乳动物等)以及与传统农药无交互抗性,具有很好的发展前景。

二酰胺结构鱼尼丁受体杀虫剂的研究进展

二酰胺类鱼尼丁受体杀虫剂因结构新颖、作用机理独特、杀虫活性高而受到广泛的关注。本文介绍了2007年以来国内外在二酰胺类邻苯二甲酰胺类和邻甲酰氨基苯甲酰胺类鱼尼丁受体杀虫剂方面的最新研究进展。

草地贪夜蛾鱼尼丁受体与双酰胺类杀虫剂的结合模式及抗性风险分析

为研究草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(以下简称FAW)对双酰胺类杀虫剂的抗性机制,根据FAW鱼尼丁受体(ranodine receptor,RyR)跨膜区域的氨基酸序列,通过同源建模的方法构建其三维结构;通过对比FAW与小菜蛾Plutella xylostella(以下简称DBM)RyR跨膜区域的氨基酸序列,发现两者具有较高的同源度,进而根据已报道的FAWRyR的突变位点I4734M及DBMRyR的突变位点G4946E(对应FAWRyR的G4891),在FAWRyR中引入突变,采用分子对接的方法分别分析其突变前后与5种双酰胺类杀虫剂的结合模式。结果表明:FAWRyR的I4734M突变模型与5种双酰胺类杀虫剂的亲和力与野生型的无明显差别,均存在氢键、卤键、疏水作用、π-π相互作用及π-阳离子作用等非共价相互作用;但G4891E突变模型与5种双酰胺类杀虫剂的亲和力下降、形成的作用力方式减少,从而影响RyR与双酰胺类杀虫剂的结合稳定性。本研究分析发现,FAWRyR的G4891E突变可能导致其对双酰胺类杀虫剂产生抗性,需在今后的研究中关注该突变。该研究结果还可会为基于鱼尼丁受体设计杀虫剂提供参考。

鱼尼丁受体类新型杀虫剂氯虫酰胺的研究概述

作用于鱼尼丁受体的氯虫酰胺是一种高效、低毒、作用机制独特的新型杀虫剂。其通过诱导鱼尼丁受体调解细胞内Ca2+释放,从而表现出杀虫作用。本文介绍了鱼尼丁受体类杀虫剂的研究进展以及对氯虫酰胺的基本性能,作用机理,合成方法和开发进展等方面的研究情况作了概述。

鱼尼丁受体抑制剂的研究进展

介绍了新型鱼尼丁受体抑制剂类杀虫剂的研究进展,包括近年来国内外农药公司报道的活性化合物和氟虫酰胺及氯虫酰胺的创制经纬。以氟虫酰胺和氯虫酰胺的结构为基础分别对邻苯二甲酰胺类和邻甲酰胺基苯甲酰胺类鱼尼丁抑制剂的研究现状做了分类介绍,并对鱼尼丁抑制剂研究前景进行展望。

4种鱼尼丁受体杀虫剂对小菜蛾及半闭弯尾姬蜂的选择毒力

[目的]评价4种鱼尼丁受体杀虫剂对小菜蛾及其天敌半闭弯尾姬蜂的选择毒力。[方法]采用浸叶法和试管药膜法分别测定4种杀虫剂对小菜蛾3龄幼虫和半闭弯尾姬蜂成蜂的毒力,采用试管药膜法和浸渍法测定4种杀虫剂田间推荐浓度对半闭弯尾姬蜂成蜂和蛹的室内活性。[结果]4种杀虫剂对小菜蛾幼虫的毒力顺序为四氯虫酰胺>溴氰虫酰胺>氯虫苯甲酰胺>氟苯虫酰胺,其LC50值分别为0.248、0.433、2.563、2.997mg·L^-1;对半闭弯尾姬蜂成蜂的毒力顺序为溴氰虫酰胺>四氯虫酰胺>氯虫苯甲酰胺>氟苯虫酰胺,其LC50值分别为5.600、51.310、121.256、>2000mg·L^-1;氟苯虫酰胺的选择毒力指数最高,大于667.3,其次是四氯虫酰胺,选择毒力指数为206.9,这2种杀虫剂对寄生蜂及小菜蛾具有高度正向选择性,氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺的选择毒力指数分别为47.3和12.9,具中度正向选择性。4种杀虫剂田间推荐浓度对半闭弯尾姬蜂蛹的羽化无影响,氟苯虫酰胺对成蜂存活无影响,但溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和四氯虫酰胺显著降低成蜂的存活率,表明这3种药剂对半闭弯尾姬蜂成蜂具有一定的副作用。[结论]研究结果对4种鱼尼丁受体杀虫剂的合理应用及小菜蛾综合治理具有指导意义。

碳硫双手性邻苯二甲酰类鱼尼丁受体杀虫剂研究进展

近年来在开展具有新型作用机制的鱼尼丁受体杀虫剂创制研究中,笔者课题组首次报道了新型碳硫双手性邻苯二甲酰类鱼尼丁受体杀虫剂的设计合成以及其生物活性研究,所总结的构效关系对这类生态友好的杀虫剂的创制研究具有一定的指导意义。

氯虫苯甲酰胺对菜青虫鱼尼丁受体基因表达量的影响

利用荧光定量PCR技术比较了氯虫苯甲酰胺敏感和抗性种群菜青虫中鱼尼丁受体基因表达量的差异,并研究了低剂量的氯虫苯甲酰胺连续和间断饲喂敏感菜青虫后其鱼尼丁受体基因表达量的变化趋势。结果表明:抗性种群菜青虫鱼尼丁受体基因表达量是敏感种群表达量的6.32倍;低剂量的氯虫苯甲酰胺可使菜青虫蛹(3龄幼虫处理后12 d)中的鱼尼丁受体基因表达量显著增加;连续饲喂可使菜青虫鱼尼丁受体基因持续高表达,而间断饲喂后第8天表达量显著降低。

4种鱼尼丁受体类杀虫剂活性研究

采用叶片饲喂法,在处理后72 h,测定了4种鱼尼丁受体类杀虫剂对3种鳞翅目害虫(黏虫、甜菜夜蛾、小菜蛾)的活性,为其合理使用提供依据。试验结果表明:四氯虫酰胺和氯虫苯甲酰胺对3种鳞翅目幼虫的活性较高,均高于氟苯虫酰胺和溴氰虫酰胺的活性;4种鱼尼丁受体类杀虫剂对小菜蛾卵基本无活性;在不同亚致死剂量下,4种鱼尼丁受体类杀虫剂处理小菜蛾后,可使小菜蛾幼虫的体重降低,发育速度变缓。应用该类杀虫剂防治鳞翅目害虫的最佳时期应为卵孵化盛期至低龄幼虫活动期。不同亚致死剂量的4种鱼尼丁受体类杀虫剂处理小菜蛾后,均能对小菜蛾幼虫的正常生长产生影响。

甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性种群选育及鱼尼丁受体基因表达特征

为明确甜菜夜蛾Spodoptera exigua对氯虫苯甲酰胺的抗性发展及抗性种群中鱼尼丁受体(ryanodine receptor,RyR)基因的表达量变化,室内采用饲料混毒法进行甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性选育,荧光定量PCR技术研究了抗性和敏感种群之间RyR基因mRNA表达量的差异。结果表明,室内选育31代后获得一个抗性倍数为105.60倍的甜菜夜蛾抗性种群,其mRNA表达量在甜菜夜蛾不同发育阶段及抗性种群和敏感种群之间均存在差异,以表达量最低的卵期作为对照,抗性种群中1龄幼虫表达量最高,是卵期的154.58倍;其次是雄性成虫,其表达量是卵期的101.51倍;2~5龄幼虫分别是卵期的59.56、35.35、72.99和19.84倍。抗性种群中1、2和4龄幼虫mRNA表达量分别是敏感种群的5.99、2.79和2.14倍,其余阶段低于敏感种群。表明甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗药性可能主要表现在幼虫阶段,RyR基因的表达量变化与氯虫苯甲酰胺诱导有关。