海水鱼肠道中丁酸梭菌的筛选及发酵工艺优化

为对海水鱼肠道中的丁酸梭菌进行分离筛选并且对其发酵工艺进行改良优化,首先利用含有RCM培养基筛选出厌氧菌株,通过革兰氏染色、菌体形态、厌氧特性筛选出1株丁酸梭菌,对其进行16S rDNA序列和系统发育树分析鉴定,进行单因素实验并且在此基础上进行正交试验改良其发酵工艺。试验结果显示,经过鉴定菌株CBL1为丁酸梭菌,并确定菌株CBL1的发酵工艺最优条件为:发酵温度为37℃、发酵时间为24 h、接种量3%、大豆蛋白胨40 g/L、葡萄糖35 g/L、碳酸氢钠1.5 g/L、氯化钠5 g/L、乙酸钠3 g/L、盐酸半胱氨酸0.5 g/L,在此条件下丁酸梭菌CBL1的发酵液活菌数为2.85×10^(9) CFU/mL。本研究结果对水产养殖中丁酸梭菌制剂的开发具有一定的参考价值。

鱼肠道中高产苯乳酸乳酸菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

该研究通过采用高效液相色谱(HPLC)法测定苯乳酸含量,从50株鱼肠道来源的乳酸菌中筛选高产苯乳酸的菌株,通过形态观察、生理生化试验及分子生物技术对其进行菌种鉴定,并以苯乳酸产量为响应值,通过单因素试验和响应面试验对其产苯乳酸发酵条件进行优化。结果表明,筛选到1株产苯乳酸能力较好的菌株DY2,其苯乳酸产量达2.45 mg/mL,经鉴定,菌株DY2为融合魏斯氏菌(Weissella confuse)。菌株DY2产苯乳酸的最适发酵条件为初始pH 6.0,发酵时间50 h,接种量3%、发酵温度34℃。在此优化条件下,苯乳酸产量达2.99 mg/mL,是优化前的1.22倍。

牙鲆鱼肠道弧菌感染症及病原特性研究

对一起养殖牙鲆Paralichthys olivaceus病害进行了发病情况、临床表现、病理变化及病原学方面的检验,结果表明为细菌性败血感染症。经过对10尾病(死)牙鲆做病变肝组织及腹水中细菌的染色检查,取其中6尾的肝、肾、腹水为材料做细菌分离与纯培养后进行形态及理化特性测定,选择代表菌株进行16S rRNA基因序列测定及系统发育学分析,结果表明分离做纯培养的12株菌(HQ010223-1至HQ010223-12)为同种细菌———弧菌属Vibrio的鱼肠道弧菌V.ichthyoenteri。经以代表菌株(HQ010223-1)对健康牙鲆做人工感染试验,表明该菌在所检牙鲆病例的相应病原学意义;用37种抗菌类药物对6株菌所做的药敏试验,结果显示在不同菌株间无明显的敏感与耐药性差异。

红鳍东方鲀病原鱼肠道弧菌的生物学特性研究

对引起红鳍东方鲀发病死亡的病原细菌进行了分离和主要生物学特性研究,包括病原性、形态特征、理化特性、16S rRNA基因序列及其系统发育学分析、胞外酶及溶血素活性、K抗原及耐药性等。结果表明,引起红鳍东方鲀发病死亡的病原细菌为弧菌属(VibrioPacini 1854)的鱼肠道弧菌(V.ichthyoenteri Ishimaru,et al.1996),2株代表菌株16S rRNA基因序列(GenBank登录号分别为:EF611424和EF635304)与GenBank数据库中鱼肠道弧菌的同源性在98%—100%,且在构建的MP系统发生树中与鱼肠道弧菌聚为一个分支。分离菌不具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、DNA酶、脲酶、明胶酶和卵磷脂酶活性,且在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上不溶血。不具有K抗原。人工感染试验中分离菌对红鳍东方鲀表现出明显的致病性。药敏试验结果显示,4株分离菌对供试37种抗菌药物中的苯唑青霉素和杆菌肽2种耐药。

鱼肠道弧菌外膜蛋白抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠法和苯甲基磺酰氟法提取鱼肠道弧菌外膜蛋白。SDS-PAGE图谱显示,PMSF提取的鱼肠道弧菌有19条带,Sarkosyl法提取的鱼肠道弧菌有14条带,其中111、105、87、78、61、58、53、48、45、40、36、33、32、31 kD蛋白带为2种方法共同条带,101、55、42、27、25 kD为PMSF法特有条带。此外,以制备的兔抗鱼肠道弧菌全菌血清为第一抗体,应用Western-blotting技术分析了鱼肠道弧菌外膜蛋白的抗原性,结果显示分子量为106、87、61、58、55、42、36、32 kD的8条蛋白带发生了免疫反应。

鱼肠道弧菌间接ELISA快速检测法的建立

为准确、快速诊断鱼肠道弧菌感染所致的海水鱼类全身性败血症,以鱼肠道弧菌为抗原,制备抗鱼肠道弧菌多克隆抗体,建立了鱼肠道弧菌间接酶联免疫吸附检测方法。该方法最佳反应条件为:抗原包被密度为107 cfu/mL,免疫血清稀释度为1∶211。病原菌检测灵敏度为每孔105 cfu/mL。抗血清与迟缓爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌、恶臭假单胞菌、鱼肠道弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻胶弧菌、秦皇岛弧菌8种水产致病菌的交叉反应结果呈阴性。用该法检测人工感染后的牙鲆和健康牙鲆,在发病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、腹水等处检测出病原菌而健康鱼则为阴性。该技术能够准确、快速检测出鱼肠道弧菌。

海水鱼肠道源性抗哈维氏弧菌乳酸菌的筛选与鉴定

哈维氏弧菌是引起对虾和鱼弧菌病的主要病原菌,给海产养殖业造成重大的经济损失。利用1.0%Ca CO3MRS琼脂从鲈鱼、刀鱼、牙鲆和大菱鲆等海水鱼肠道中分离到49株乳酸菌,采用牛津杯琼脂扩散法从中筛选出对哈维氏弧菌具有较强拮抗作用的菌株YP4-5,抑菌直径为18.26 mm。通过蛋白酶、p H值和温度等因素对菌株YP4-5的无细胞上清液(cell free supernatant,CFS)抑菌物质进行初步分析,表明抑菌活性物质对蛋白酶敏感,p H2.5~4.5时对哈维氏弧菌具有抑制作用,具有良好的热稳定性,初步判断YP4-5 CFS中抑菌活性物质为细菌素类。0.4倍最小抑菌浓度YP4-5 CFS可有效抑制74.74%哈维氏弧菌的生长,扫描电子显微镜观察结果表明YP4-5 CFS使哈维氏弧菌细胞完整性破坏,细胞膜溶解,胞内物质外泄。经生理生化和16S r RNA鉴定菌株YP4-5为清酒乳杆菌,为预防和控制水产养殖中哈维氏弧菌感染研发微生态制剂提供良好的菌源。

鲤鱼肠道细菌的分离及其生理生化特性研究

从鲤鱼肠道中分离纯化细菌,获得CC-1、CC-2两株菌株,并进行生理生化特性、药敏试验研究。结果表明,CC-1和CC-2菌株均产生苯丙氨酸脱氢酶,分解葡萄糖产气,不产生硫化氢;CC-1菌株产生赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶,CC-2菌株则不产生;CC-1、CC-2菌株对头孢菌素类、氨基甙类、大环内酯类、磺胺类等抗生素敏感,而对氨苄青霉素、利福平、萘啶酸、头孢噻吩、先锋霉素等敏感性不同。该研究可为治疗鱼类疾病以及合理开发利用肠道微生物资源提供参考。

鱼肠道弧菌单克隆抗体流式细胞术检测技术的研究

以抗鱼肠道弧菌单克隆抗体为基础,结合流式细胞术,根据荧光信号强弱比例确定检测鱼肠道弧菌时所需单克隆抗体的最优反应量为200μL,最佳反应时间为45min。在最优反应条件下,抗鱼肠道弧菌单克隆抗体可特异性识别鱼肠道弧菌,阳性荧光信号比例达12.9%;对不同密度的鱼肠道弧菌进行重复性试验,变异系数均在5%以内,说明流式细胞术具有较好的精密度;人工感染健康牙鲆试验表明,流式细胞术检测法能快速从发病鱼的鳃、肝、脾、肾、腹水等部位检测出病原菌,而对照组为阴性;本试验建立的鱼肠道弧菌单克隆抗体流式细胞术检测技术为鱼肠道弧菌的快速检测提供了新方法。

鱼肠道弧菌单克隆抗体的制备及应用

以鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri为抗原免疫小鼠,用PEG法将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,分别采用酶联免疫吸附(ELISA)技术和间接免疫荧光抗体(EFAT)技术筛选强阳性杂交瘤细胞株,亚克隆阳性细胞株,获得5株抗鱼肠道弧菌单克隆抗体(1C6、1D8、2D7、2D10、2E3)。Western blotting分析结果显示,单抗2D10与相对分子质量为44 200、36 700的鱼肠道弧菌蛋白发生特异性结合;用流式细胞术(FCM)检测单抗强度,结果显示阳性荧光比例为13.63%,阴性对照荧光比例不足1%;人工感染牙鲆试验结果表明,运用该单抗能够建立鱼肠道弧菌的快速诊断方法。

鲈鱼肠道LactobacillussakeiLY1-6对荧光假单胞菌抑制作用研究

目的：从海鱼肠道中筛选对荧光假单胞菌具有较强抑制作用的乳酸菌。方法：采用牛津杯琼脂扩散法筛选菌株，通过生理生化反应和16SrRNA测序进行菌株生物学鉴定，利用蛋白酶、pH和温度等因素对抑菌活性进行分析，采用扫描电镜分析乳酸菌无细胞上清液（CFS）对荧光假单胞菌细胞结构的完整性影响。结果：从鲈鱼肠道中筛选出对荧光假单胞菌具有较强抑制活性的菌株LY1—6，经生理生化和16SrRNA测序鉴定为清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）。菌株LY1—6CFS经胃蛋白酶处理后其抑菌活性完全丧失，经中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶处理后其抑菌活性分别丧失了38．22％、38．00％、22．48％和18．46％。在pH2．5—5．0具有抑菌活性，并具有良好的热稳定性，初步结果表明LY1—6CFS中抑菌活性物质可能为细菌素。扫描电镜结果表明经LY1—6CFS处理使荧光假单胞菌细胞结构被破坏并溶解。结论：来自鲈鱼肠道的清酒乳杆菌LY1—6对荧光假单胞菌具有较强抑制作用，其抑菌活性物质为细菌素类，作用机制为破坏细胞的完整性，可作为控制水产品中荧光假单胞菌腐败生物保鲜的出发菌株。

鱼肠道弧菌免疫检测方法的研究

采用灭活的鱼肠道弧菌作为抗原,制备兔抗血清,建立了鱼肠道弧菌的间接荧光抗体检测技术(indirect im-munofluorescence assay test,IFAT)、Western-blotting免疫印迹检测技术。IFAT结果显示阳性信号覆盖整个菌体,明亮,清晰,荧光信号呈长弧形且两端钝圆,与鱼肠道弧菌形状一致。Western-blotting结果显示共10条蛋白带发生免疫反应,其中6条蛋白带结果较清晰,显示出较强的特异性免疫反应,阴性对照组无条带。IFAT和Western-blotting结果说明所建立检测方法能够准确、快速的检测出鱼肠道弧菌。

鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗对牙鲆免疫效果的初步研究

为研究鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗对牙鲆的免疫效果,用该种疫苗对牙鲆进行了免疫试验。给牙鲆注射鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗,饲养25 d后分别用鱼肠道弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌进行攻毒,20 d后分别统计各组鱼的免疫保护率。结果表明,该疫苗对鱼肠道弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌的免疫保护率分别为84.6%、30.8%、33.3%。

新疆冷水鱼肠道中耐低温乳杆菌的分离筛选及其遗传差异分析

乳杆菌能够维持肠道内正常菌群的平衡,而来源于动物肠道的乳杆菌更容易在肠道内生长繁殖,所以分离冷水鱼肠道内的低温乳杆菌具有重要的应用价值。利用MRS、M17、改良番茄和乳杆菌选择性琼脂培养基4种培养基,从6种不同的冷水鱼肠道以及粘膜中分离筛选出耐低温的乳杆菌20株。通过一些生理生化试验初步确定疑似乳杆菌菌株24株,并测定其最适生长温度,其中有7株为嗜冷菌,17株为耐冷菌。根据16Sr RNA基因序列构建系统发育树可知,20株菌隶属Lactobacillius spp.,其他4株分别隶属Clostridium spp.和Pseudomoncs spp.。

罗非鱼幼鱼肠道微生物基因组DNA的提取

以提取幼鱼肠道微生物总DNA的浓度、OD260/280、及对ERIC-PCR和PCR-DGGE指纹图谱的影响作为判断依据,比较了3种不同幼鱼肠道微生物总DNA的提取方法。结果表明方法2提取的总DNA的浓度明显高于方法1和方法3;3种方法获得总DNA的纯度相似,OD260/280在1.8～1.9间;对ERIC-PCR和PCR-DGGE指纹图谱分析表明,3种方法中方法2提取的DNA最能反映出幼鱼肠道微生物的多样性。

斜带髭鲷感染鱼肠道弧菌的分离及分析

[目的]对患病斜带髭鲷(Hapalogenys nitens)幼鱼进行病原菌的分离及鉴定。[方法]对2013年1月福州罗源湾某海水网箱养殖场斜带髭鲷幼鱼死亡病例进行了发病情况、临床表现及病原学方面的检验;对其中5尾患病斜带紫鲷的肝脏、脾脏、肾脏及鳃丝进行细菌分离与纯培养,对病原菌进行形态、生理生化测定和16S rRNA基因序列测定及系统发育学分析,并用30种抗菌类药物对5株菌进行了药敏试验。[结果]斜带髭鲷幼鱼死亡病例为细菌性感染症,分离纯培养的菌株(fzlyw201301071和fzlyw201301072)与弧菌属(Vibrio)的鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)可认定为同一种属。药敏试验结果显示,在不同菌株间无明显的敏感与耐药性差异。[结论]为水产养殖动物的疾病防治提供了理论依据。

鱼肠道弧菌疫苗制备及免疫保护效果

通过比较不同灭活剂及灭活条件对鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)的灭活效果,确定以0.4%(v/v)福尔马林溶液在25℃下处理30h作为疫苗的最佳灭活条件,用灭活的鱼肠道弧菌疫苗免疫大菱鲆并测定了该疫苗针对鱼肠道弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibri parahaemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarium)等的免疫保护力,结果表明,采用注射免疫方式接种后,针对鱼肠道弧菌的免疫保护率达75%;溶藻弧菌免疫保护率为67.6%;鳗弧菌免疫保护率为50%;副溶血弧菌免疫保护率为57.2%;采用浸浴免疫方式接种后,疫苗针对鱼肠道弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌的免疫保护力分别为25%、22.3%、11.1%、12.5%。

利用鱼抗血清及鼠抗血清分析鱼肠道弧菌全菌蛋白抗原性

从患腹水症牙鲆脾脏组织中分离得到一株优势菌株CD86,经人工感染实验证实菌株CD86对牙鲆有较高的致病力,其半致死浓度为1.8×105 CFU/尾。通过生理生化特征测定和16SrDNA基因序列分析,判定菌株CD86为鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)。以福尔马林灭活的菌株CD86全菌分别免疫健康的小鼠和牙鲆,ELISA测定鼠抗血清和牙鲆抗血清效价分别为12 800和1 200。利用间接免疫荧光技术检测2种抗血清与菌株CD86的结合活性,结果显示,2种血清均可同菌体发生阳性反应,其中鼠抗血清阳性反应信号明显强于鱼抗血清。同时,利用Western blotting分析了菌株CD86全菌蛋白的抗原性,结果显示分子量为27、30和37kDa的菌体蛋白条带与2种血清均发生阳性反应;分子量为19、25、28、29和35kDa的菌体蛋白条带仅与鼠抗血清发生阳性反应;分子量为45kDa的菌体蛋白条带只与鱼抗血清发生阳性反应。研究结果表明,牙鲆对菌体抗原产生的抗体应答与小鼠存在明显差异,该发现对研筛鱼用高效的鱼肠道弧菌亚单位疫苗具有重要的参考价值。

新疆冷水鱼肠道肉杆菌遗传差异及抑菌特性分析

从7种新疆冷水鱼肠道中分离筛选低温益生乳酸菌,根据16S rRNA基因序列结合多重聚合酶链式反应指纹分型技术对菌株遗传结构差异进行分析,结果显示其中15株隶属于肉杆菌属(Carnobacterium),包括两个已知C.divergens(10株)和C.maltaromaticum(4株)及未鉴定的菌株Carnobacterium spp.编号(1株)。采用牛津杯法初筛显示8个菌株代谢物对3种致病菌均有不同程度的抑制作用,对单核细胞性李斯特菌的抑菌效果最明显。8个菌株发酵上清液经排除有机酸、过氧化氢及蛋白酶实验处理,发现除菌株BS-JYC-3经胰蛋白酶处理抑菌活性未丧失外,其余菌株经酶解实验抑菌能力完全丧失,表明发酵上清液中抑菌物质可能为类细菌素。药敏实验显示所有菌株对氨苄西林、米诺环素和氯霉素表现敏感,对庆大霉素、四环素、利福平及替考拉宁表现中度敏感。

健脾益气摄血颗粒对斑马鱼肠道出血模型的止血作用评价

目的建立斑马鱼血小板计数减少并发肠道出血模型,观察健脾益气摄血颗粒对斑马鱼肠道出血的止血效果,为临床推广应用提供依据。方法在检测最大致死药物浓度后,用辛伐他汀诱导斑马鱼肠道出血模型,并以确定的健脾益气摄血颗粒56、167和500μg/ml 3个不同剂量为干预药物,以斑马鱼肠道出血发生率、肠道出血减少率以及止血率为评定指标,观察健脾益气摄血颗粒对斑马鱼肠道出血的止血效果。结果模型对照组斑马鱼肠道出血发生率为70%,经健脾益气摄血颗粒56、167和500μg/ml浓度干预后,斑马鱼肠道出血发生率分别为37%、40%和80%。其中,健脾益气摄血颗粒56μg/ml、167μg/ml两个剂量组与模型对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),表明健脾益气摄血颗粒中小剂量在浓度可明显减少斑马鱼肠道出血的发生率。模型对照组斑马鱼肠道内血小板计数为16.60个,经健脾益气摄血颗粒56、167和500μg/ml浓度干预后,斑马鱼肠道内血小板计数分别为7.60、8.00和15.50个,与模型对照组比较,差异有统计学意义(P分别为<0.01、0.01、0.05)。肠道止血作用分别为54%、52%和7%。表明健脾益气摄血颗粒中小剂量对斑马鱼肠道出血具有明显的止血效果。结论健脾益气摄血颗粒小剂量(56μg/ml)与中剂量(167μg/ml)不但能够明显减少斑马鱼肠道出血率,也有良好止血疗效。