转抗菌肽基因鱼腥草的筛选及稳定性分析

【目的】筛选转基因鱼腥草,并初步分析外源基因在鱼腥草植株中的稳定性。【方法】以选择培养基中生长的转基因鱼腥草为材料,通过卡那霉素(Kan)叶片涂抹法进一步筛选抗性植株,并进行Kan抗性基因nptⅡ和目的基因CN(cecropin B/NP-1)的PCR分析。【结果】Kan叶片涂抹法筛选的最佳浓度为5 000 mg/L,观察时间以4 d为宜;经PCR检测验证,Kan抗性植株的nptⅡ基因阳性率达到96%,其中目的基因CN阳性率为37%。【结论】建立了适用于转基因鱼腥草的快速筛选方法,转基因鱼腥草中目的基因CN的稳定性低于抗性基因。

鱼腥草离体再生及农杆菌介导的遗传转化

【目的】建立鱼腥草离体再生系统和农杆菌介导的遗传转化方法。【方法】以鱼腥草叶片为外植体置于不同激素配比的MS培养基上,进行愈伤组织诱导和分化再生。以根癌农杆菌EHA105/pCAMB IA1305.2进行转化,将外源GUS(β-葡萄糖醛糖苷酶)基因、潮霉素抗性基因转入鱼腥草,以组织化学染色法检测GUS活性,以聚合酶链反应(PCR)法鉴定基因组中的GUS基因。【结果】MS培养基中添加0.1 mg/Lα-奈乙酸(NAA)、2.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)、0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤(KT)适于以鱼腥草叶片为外植体进行离体再生,出芽率达96.7%。潮霉素作为筛选试剂,使用浓度为2.5 mg/L;头孢霉素作为抑菌剂,使用浓度为250 mg/L。经感染的外植体中GUS反应呈阳性的占75.0%,8周统计抗性芽比率5.5%,PCR分析表明GUS基因已整合到鱼腥草基因组中。【结论】通过鱼腥草离体培养条件的研究及根癌农杆菌介导的遗传转化,获得了较高的离体再生率,实现了鱼腥草的遗传转化。