鸡鲍氏志贺菌ipaH基因的克隆与序列分析

利用PCR技术扩增鸡鲍氏志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(invasive plasmid,ipaH),并与GenBank数据库中不同菌株进行序列比对与同源性分析。结果显示,分别扩增出ipaH_1、ipaH_2、ipaH_3、ipaH_4、ipaH_5和ipaH_6等目的基因。核苷酸序列比对和同源性分析结果显示,鸡鲍氏志贺菌6个ipaH基因片段均与美国鲍氏志贺菌CP001063的核苷酸序列同源性最高,其次是中国鲍氏志贺菌CP000036,提示鸡鲍氏志贺菌可能起源于人鲍氏志贺菌。

鸡源鲍氏志贺菌hn03株的分子鉴定与演化分析

以鸡源鲍氏志贺菌为研究对象,根据GenBank中收录的相应序列针对8个看家基因thrB/thrC、trpC/tr-pB、purM/purN、mdh/argR设计相应引物,分别扩增出8个目的基因,然后克隆到pMD18-T vector,进一步测定序列,并将序列测定结果登陆GenBank。利用BLAST和ClustalX程序分析测序结果,构建了8个看家基因在染色体上4个区域的相应遗传进化树。由构建的系统进化树可知:志贺菌分为3个主要分支,且均落在大肠杆菌中,本研究中的分离菌株鸡源鲍氏志贺菌在染色体上4个区域的进化树中分布位置一致,均落在志贺菌3个主要分支中的第一分支;从整个基因水平上看,鸡源鲍氏志贺分离株应起源于人源志贺菌。

1株与鲍氏志贺菌1～6型交叉凝集的阴沟肠杆菌分析

1临床资料与方法 1．1背景资料①临床资料：腹泻患儿，男，出生9日，无发热、呕吐、腹泻，大便黄绿色、稀黏、量少，次数多，日排便5～10次；诊断：菌痢？坏死性结肠炎。

牦牛源鲍氏志贺菌人工感染BALB/c小鼠的组织病理学观察

为了解牦牛源鲍氏志贺菌对实验动物除肠道外的心、肝等的快速致病性损伤,本研究以牦牛源鲍氏志贺菌感染SPF小鼠,剂量为0.5mL·只-1(2×109 CFU·mL-1),感染后6、18、30、42、54、66h剖杀、取样并对剖解进行详细观察,在每个安排的时间点平行采集3只小鼠的脑、心、肝、脾、肺、肾、小肠、大肠和胰腺等组织,制备组织切片,通过HE染色和免疫组化染色,对感染小鼠的组织病理学变化和细菌定位进行观察,收集小鼠血液进行乳酸脱氢酶、尿素、肌酐、α-淀粉酶、甘油三酯、总蛋白、白蛋白、磷酸激酶、CO2结合力、P、血糖、白细胞数等血液生化指标检测。试验结果表明,小鼠除小肠上皮细胞损伤外,心外膜下出现凝固性坏死病灶,肝组织有炎性细胞浸润及肉芽肿形成,肺泡壁炎性细胞浸润,胰腺上皮细胞肿胀,细胞质溶解,细胞核固缩或碎裂等;心肌细胞、肝细胞、肺泡壁、肾小管细胞、胰岛细胞、肠上皮细胞细胞质内均有待检菌体抗原阳性反应;生化指标除甘油三酯外均有一定变化。试验证实病变的严重程度与菌体抗原检出量成正相关,分离株能在实验动物体内进行大面积侵嗜,心、肝、肺、胰腺、肾也是牦牛源鲍氏志贺菌分离株的主要靶器官。生化指标和病理损伤的特征性变化对该病诊断与研究拓展具有重要价值。

应用MALDI-TOF-MS自建鲍氏志贺菌蛋白指纹图谱数据库的研究

目的运用MALDI-TOF-MS技术建立鲍氏志贺菌的蛋白指纹图谱并将其添加至数据库,实现对临床细菌的快速鉴定,便于临床医生对疾病进行快速而有效的控制。方法采用甲酸萃取法进行鲍氏志贺菌蛋白指纹图谱的添加,研究不同的标本前处理方法对鉴定结果的影响,并用新分离的鲍氏志贺菌和大肠埃希菌对图谱进行验证。结果采用新的图谱鲍氏志贺菌提取法鉴定准确率为95%,直接涂抹法准确率为79%,对大肠埃希菌的鉴定准确率为97%。鲍氏志贺菌不同处理方法的鉴定准确率比较,差异有统计学意义(P<(0.05)。结论新添加的鲍氏志贺菌蛋白指纹图谱能快速准确地鉴定鲍氏志贺菌,此图谱可以应用于鲍氏志贺菌的临床快速诊断。

鸡源鲍氏志贺菌的RAPD分析

【目的】确定鸡源鲍氏志贺菌的进化地位。【方法】选用6条随机引物（P1～P6）,采用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术,对1株鸡源鲍氏志贺菌、2株鸡白痢沙门菌、2株鸡肠致病性大肠杆菌和2株痢疾志贺菌共7株菌的基因组DNA进行分析,同时对个别特殊序列进行克隆测序,并在此基础上分析了鸡源鲍氏志贺菌与其他15个相关菌株的进化关系。【结果】6条随机引物中有4条引物（P1,P2,P4和P6）能较好地在志贺菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡致病性大肠杆菌3种菌中检测到多态性分子标记;这4条有效引物共扩增出了64个DNA片段,其中7个菌株共有的谱带有3条,多态性片段有61条,多态率达95.3%。引物P2可根据扩增图谱将志贺菌和大肠杆菌与沙门菌鉴别出来;用引物P6对上述7株细菌进行扩增,发现同种菌株间谱带特别相似,其中鸡鲍氏志贺菌与人痢疾志贺菌扩增条带的相同率达66.7%,与鸡肠致病性大肠杆菌扩增条带的相同率达44.4%,而鸡白痢沙门菌与志贺菌的扩增谱带相差甚远,可用于3种细菌的鉴别。对扩增片段进行的测序及进化分析结果显示,鸡源鲍氏志贺菌与人源志贺菌的进化距离最近。【结论】鸡源鲍氏志贺菌可能是人源志贺菌的一个变异株或新的亚种。

鸡鲍氏志贺菌与痢疾志贺菌鸡白痢沙门菌及肠致病性大肠杆菌RAPD鉴别方法的建立

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对鸡鲍氏志贺菌、鸡白痢沙门菌、肠致病性大肠杆菌和痢疾志贺菌的基因组DNA进行了研究，在此基础上分析了鸡鲍氏志贺菌与其他6个菌株的亲缘关系。结果显示，有4条随机引物的扩增多态性良好，共扩增出了64个DNA片段，其中4种菌共有的谱带有3条，而显示多态性的片段有61条，占95．3％。引物P2的扩增图谱不能将志贺菌和大肠杆菌鉴别开，但可将这2种菌与沙门菌鉴别出来；引物P6的扩增图谱清晰且3种菌间有明显差异，可用于上述3种细菌的鉴别。不同细菌间的遗传距离为0．128～0．790，根据遗传距离可将鸡鲍氏志贺菌等7个菌株分为3个聚类群，鸡鲍氏志贺菌分离株位于人痢疾志贺菌类群中，可能是人志贺菌的一个新的亚种。

牦牛源鲍氏志贺菌的鉴定及对BALB/c小鼠的致病性

本试验旨在对从待屠宰健康牦牛中分离的志贺菌进行鉴定及确定分离株的致病性。通过形态染色、培养特性、生化特性、血清型鉴定、16SrRNA基因序列分析以及BALB/c小鼠的LD50测定等方面对分离株进行系统鉴定,并对分离株进行电镜观察和药敏试验。结果显示,分离株形态染色、培养和生化特性符合志贺菌的特点,血清型鉴定为鲍氏6型志贺菌,16SrRNA基因序列系统演化分析表明,分离菌株与人源鲍氏志贺菌和宋内志贺菌亲缘关系近,而与其他动物志贺菌亲缘关系较远,分离株对BALB/c小鼠具有致病性,其LD50值为2.5×107.5 CFU,药敏试验结果显示分离菌株对常用抗生素无耐药性。本次试验首次从健康牦牛中分离的鲍氏6型志贺菌具有较强的致病性,与人源菌株亲缘关系较近,提示牦牛中分离的鲍氏志贺菌具有公共卫生学意义。

鲍氏志贺菌临床分离株的毒力基因检测及分子分型

目的：了解鲍氏志贺菌临床分离株毒力基因分布、耐药性、分子分型及菌株间流行病学相关性。方法从我院2015年6月—10月间门诊就诊腹泻病患者的粪便中分离收集9株鲍氏志贺菌。采用K-B纸片扩散法行抗生素药敏试验，聚合酶链反应技术检测毒力基因，脉冲场凝胶电泳技术及多位点序列分型确定分子分型，分析菌株间流行病学相关性。结果9株鲍氏志贺菌共分为3个血清亚型：Ⅰ型1株，Ⅱ型3株，Ⅳ型5株。9株菌均为多重耐药菌：对氨苄西林耐药率为9/9，对头孢他啶、链霉素、庆大霉素、复方新诺明、头孢噻肟、头孢曲松、四环素、诺氟沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为1/9、4/9、4/9、4/9、5/9、5/9、6/9、6/9、6/9，未发现阿米卡星、头孢哌酮-舒巴坦和亚胺培南耐药株；ipaH的检出率为100%，sen、set1A、set1B、ial、virA、icsA、sigA的检出率均为0，pic、sepA、sat的检出率分别为4/9、5/9、7/9；9株鲍氏志贺菌通过脉冲场凝胶电泳共分为8种谱型，相似性在63.21%-100%。多位点序列分析结果显示6株为ST648，2株为ST131、1株为ST10。结论本院分离的9株鲍氏志贺菌共分3个血清亚型，多重耐药情况严重，菌株间亲缘关系相对较远，属非暴发病例。

16S rRNA基因联合gyrB、grpE、recA基因对鸡源鲍氏志贺菌hn03株进行分子起源分析

为了从基因水平鉴定鸡源鲍氏志贺菌,分别根据GenBank中登陆的相应序列针对16S rRNA、gyrB、grpE、re-cA 4基因设计4对引物,用PCR扩增出鸡源鲍氏志贺菌4基因的部分片段并进行了克隆测序。将所获序列与Gen-Bank中同源性较高的相关序列相比较,计算种间相似性,并构建志贺菌的系统发育树,对分离株进行分类与鉴定。研究发现,从4基因的序列分析结果总体上可知鸡源志贺菌与人鲍氏志贺菌同源关系最近,同源性达99.6%～100%。几乎所有志贺菌均落入大肠杆菌的分支中,且在鉴别细菌中recA基因和gyrB基因比传统中常用的16SrRNA基因差异更显著。由此证明用细菌分类和鉴定的"金标准"16SrRNA联合gyrB、grpE、recA3个基因进行序列分析来鉴定志贺菌是一种可靠、成本较低的方法;由上述基因序列构建的系统发育树提示,该株鸡源志贺菌可能是与人志贺菌密切相关的新种或是它们的亚种。

包被LPS抗原检测鸡源鲍氏志贺氏菌抗体的间接ELISA方法的建立

以鸡源鲍氏志贺氏菌菌体提取的脂多糖(LPS)成分作为检测抗原,以辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体为第二抗体,以TMB为显色剂,成功建立了检测鸡源鲍氏志贺氏菌抗体的间接ELISA方法.通过对间接ELISA反应条件的一系列研究,确定了各种最适工作条件:鸡源鲍氏志贺氏菌LPS抗原最适包被质量浓度为5mg·L-1,最适包被条件为4℃过夜;待检血清的最佳稀释度为1∶160,与包被抗原在37℃作用1 h;酶标二抗的最适工作浓度为1∶2 000,血清与酶标二抗的反应条件为37℃1 h;最适封闭条件为37℃作用1 h;底物最适反应条件为室温避光20 min;阴阳性临界值为0.385.经特异性试验、敏感性试验和重复性试验,表明建立的间接ELISA方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点.

鸡鲍氏3型志贺菌脂多糖及O抗原多糖的提纯与鉴定

为获得高纯度的鸡鲍氏3型志贺菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及其亚单位O抗原多糖(O-polysaccharide,OPS),采用改良热酚水法提取鸡鲍氏3型志贺菌的LPS,并联合使用葡聚糖凝胶层析得到高纯度的LPS;采用酸水解法联合葡聚糖凝胶层析获得高纯度的O-PS。生化方法检测结果显示所提纯LPS和O-PS纯度高,兔回肠襻试验结果显示所提纯的LPS活性好。本试验结果表明提取的LPS和O-PS可进行特异性研究及制备有效的候选疫苗。

鲍氏志贺氏菌18型菌株的生物学特性及分子流行病学研究

本文报告近年国内最早分离到的大同,北京,淮北地区13株鲍氏志贺氏菌18型菌株的生物学特性与分子流行病学研究结果。这些菌株在生化与抗原特性上没有差异。在药物敏感谱上显示区域倾向,淮北株与国际株对某些抗生素呈敏感型,大同,北京来源菌株呈抗性。其中1株对氯霉素耐药。质粒分析发现几乎所有菌株均具有一个120～140Md大质粒,3株具有另外的大质粒带,其中1个质粒带可能与耐氯霉素有关。淮北株与国际株,大同株之间在质粒数目,分子量大小及排列上基本各不相同,说明鲍氏18型菌株并非系新近从同外传入。大同地区在一个较短时间内分离出较多(18.8％)菌株,由于各菌株间分子生物学特性各异,因此也不是暴发流行,而仍属散发发病。

鸡鲍氏志贺氏菌脂多糖的提取方法研究

为了提取和纯化鸡鲍氏志贺氏菌脂多糖(LPS),利用1%葡萄糖肉汤培养基大量培养已分离鉴定的鸡鲍氏志贺氏菌,并应用酚水法提取鸡鲍氏志贺氏菌脂多糖。经聚乙二醇20000浓缩,DNA酶及RNA酶酶解,离心分离,冷冻干燥等制得纯化的LPS。对提取物分别进行糖、蛋白质及核酸含量测定,结果显示,所提取纯化的LPS糖含量为27.06 mg/L,蛋白质含量为0.25 g/L,核酸含量为40.20 mg/L,鲎试剂检测具有凝集活性。上述结果表明:该试验方法能有效提取鸡鲍氏志贺氏菌LPS,提取物纯度较高,核酸及蛋白质含量较低,是提取脂多糖的一种简便快捷的方法。

二株鲍氏志贺氏菌16型的分离与鉴定

1984年国际公布了3个新的鲍氏志贺氏血清型,其中鲍氏16型国内已有从腹泻病人粪便中检出的报道,但健康带菌尚未发现。作者于1989年6月自食品从业人员健康查体粪便中分离到2株(编号3462、3468),经17Kb基因探针菌落原位杂交和豚鼠角膜毒力试验,证明是2株侵袭型毒力株,现将其分离与鉴定结果报道如下。

RAPD技术在志贺菌及沙门菌鉴别中的应用

以鸡鲍氏志贺菌、鸡白痢沙门菌和痢疾志贺菌为研究对象,分别提取基因组DNA,利用6条随机引物以随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其基因组DNA进行了分析.结果表明,4条随机引物能较好地在这3种菌中检测到多态性分子标记.共扩增出了59个DNA片段,其中3个菌株共有的谱带有7条,而显示多态性的片段有52条,占88.1%.引物P6的扩增图谱可用于3株细菌的鉴别.在对3株细菌扩增中发现,鸡鲍氏志贺菌与人痢疾志贺菌的扩增条带相同率达67%,但各有自己的特征性谱带.鸡沙门菌与志贺菌的扩增谱带相差甚远.