鲑鱼甲病毒病研究进展

1疾病概述 冷水鲑科鱼类价格昂贵,是世界三大养殖鱼类之一,主要分布于欧洲和北美。目前我国的鲑科鱼养殖以虹鳟（Oncorhynchus mykiss）为主,年产量占世界总产量的1%以下,每年需要进口大量的鲑鱼,尤其是大西洋鲑鱼（Salmo salar）,鲑鱼甲病毒病对于我国的鲑科鱼养殖具有潜在的威胁。

鲑鱼甲病毒阳性核酸物质制备及RT-PCR检测方法的建立

为建立快速检测鲑鱼甲病毒(Salmonid alphavirus,SAV)RT-PCR方法,根据Gen Bank公布的E2基因序列(1 375 bp)设计引物,扩增S AV E2全长基因,利用假病毒制备技术获得包裹E2核酸物质(RNA)的SAV假病毒溶液。以SAV假病毒作为阳性核酸物质质控品,以E2F:5'CCG-TTG-CGG-CCA-CAC-TGG-ATG 3',E2R:5'CCT-CAT-AGG-TGA-TCG-ACG-GCA-G 3'为引物,优化反应条件,建立SAV的RT-PCR检测方法。结果表明,该方法可扩增SAV E2特异性516 bp的DNA片段,引物最适反应浓度为1.0μmol·L-1,最佳退火温度为57.5℃,对SAV的三种亚型SAV1(V4640)、SAV2(V4619)、SAV5(V4638)检测结果均为阳性,对SVCV、IHNV和IPNV的PCR扩增结果均为阴性;并确定对SAV的核酸最低检出量达1.59 pg;以RT-PCR方法在不同时间对每份样品作3次重复检测,检测结果一致。表明此方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性较好,可用于SAV临床诊断和检测。

鲑鱼甲病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法研究

鲑鱼甲病毒(Salmonid alphavirus,SAV)是鲑鱼胰脏病(Salmon pancreas disease,PD)病原,主要感染鲑科鱼类,目前在我国尚未分离到。为提高出入境鱼类中的SAV检测效率,根据SAV nsP1基因片段,设计3对特异性引物,建立了检测SAV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。该方法使用25μL反应体系,经优化后的反应温度为65℃,反应时间为1 h,检测限可达10个拷贝数的病毒核酸,且不与传染性鲑鱼贫血病毒、病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒、病毒性神经坏死病病毒、草鱼呼肠孤病毒和鲤春病毒血症病毒的RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后,反应结果肉眼直接可见。本研究建立的RTLAMP方法是一种特异性强、方便快捷的SAV检测方法,适合SAV的现场初筛和核酸检测。

鲑鱼甲病毒E1基因高保守区融合表达及免疫特性的分析

根据Gen Bank中公布的鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)SAV 1、SAV 2和SAV3三个基因型中E1基因,选择高保守序列702 bp(436-1137)合成基因,命名为SAV E1,将其克隆到原核表达载体p Cold TF中构建重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中,经终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达,SDSPAGE和Western blot鉴定,重组蛋白均获得了表达,表达E1重组蛋白约95 k D。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,制备抗血清。间接ELISA结果显示,鼠抗重组蛋白E1血清效价为1∶25 600;间接免疫荧光结果显示,鼠抗重组E1蛋白血清可与SAV发生特异反应,由此表明表达的E1重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,为SAV检测方法的建立提供理论依据。