鲢鱼重组cystatin C的抑菌活性及抑菌机理初探

cystatins是一类天然抗菌蛋白,广泛分布于鱼类加工废弃组织。采用滤纸片扩散法和二倍稀释法,评价了鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)重组cystatin C(HmCystatin C)对6株常见的水产品腐败菌的抑菌活性;并以铜绿假单胞菌和腐生葡萄球菌为典型受试菌,测定HmCystatin C与菌体及其细胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和肽聚糖(peptidoglycan,PGN)的结合情况,及对受试菌生长曲线、细胞壁、细胞质膜通透性的影响,初步探讨其抑菌机制。结果表明,HmCystatin C对除枯草芽孢杆菌外的5株腐败菌均具抑制作用,对典型受试菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)及最低杀菌浓度(minimal bactericide concentration,MBC)均为3.5 mg/mL;HmCystatin C能与典型受试菌结合,并且对LPS和PGN表现出亲和性。此外典型受试菌的细胞壁和细胞质膜被破坏,胞内物质渗出。因此推测HmCystatin C可能首先吸附到菌体表面并与细胞壁成分结合,进而破坏细胞完整性,导致内容物外泄后菌体死亡。该结果为阐明鱼类cystatins抑菌机制奠定实验基础,也为综合利用鱼源cystatins提供理论参考。

鲢鱼重组Cystatin及其酶解产物对草鱼冷藏肉片优势腐败菌的抑制作用

首先通过三羟甲基甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)和滤纸片法分别鉴定木瓜蛋白酶液(Papain)对鲢鱼重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)酶解程度及酶解产物对草鱼冷藏肉片中分离的3种优势腐败菌,即草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)和中间气单胞菌(Aeromonas media)的抑菌活性。结果表明,酶解6 h后的产物,即9.5 ku以下的片段对3种菌的抑菌效果均最好。再利用凝胶过滤高效液相色谱(TSK-GEL G2000SWXLHPLC)和双向电泳对6 h酶解产物进行分离纯化分析。发现仅峰T-2对3种菌均具有明显的抑制活性,峰T-2在TSK-GEL G2000SWXLHPLC上呈现单一峰,电泳得到单一蛋白点,其分子质量为8.6 ku,p I值为6.5。最后通过RPLC-MS/MS串联质谱鉴定该蛋白点,得到3个肽片段(31QSNDAFVR38、46VQQQVAAGMKY56和81NPSIEQVIQ89)且含有Cystatin特征序列QVAAG。结果提示,Cystatin蛋白(完整序列分子质量12~14 ku)内部,存在能够发挥抑菌作用的肽片段。

重组Cystatin对冷藏鲢鱼的抑菌效果

分离鉴定4℃有氧冷藏鲢鱼去皮肉片货架期终点腐败相关优势假单胞菌,并研究鲢鱼重组Cystatin(家族Ⅱ)对优势腐败假单胞菌的抑菌效果。首先利用CFC培养基从4℃有氧冷藏鲢鱼去皮肉片货架期终点,分离筛选出腐败相关假单胞菌,并采用生理生化和16 SrDNA法对其进行鉴定,其次将腐败菌株进行回接试验,通过测定各腐败菌回接组的挥发性盐基氮(TVB-N)值、菌落数、感官评分判断其致腐能力。最后,采用滤纸片扩散法和营养肉汤法鉴定重组鲢鱼Cystatin(家族Ⅱ)对优势腐败假单胞菌的抑菌效果。结果表明,荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)和草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)为主要致腐菌,所占比例分别为63.3%、26.7%,且荧光假单胞菌致腐能力强于草莓假单胞菌。重组Cystatin对两种菌均有明显的抑菌效果,且呈剂量依赖关系。

4℃下鲢鱼重组Cystatin稳定性分析

重组鲢鱼Cystatin是一种具有明显抑菌活性的半胱氨酸蛋白酶抑制因子,研究其在4℃冷藏条件下的稳定性,可为未来将Cystatin蛋白应用于食品保藏、加工奠定必要的理论和实验基础.本文首先确定鲢鱼重组Cystatin的抑制活性单位,并研究其在4℃贮藏不同时间内的活性变化趋势;同时,分别采用Tricine-SDS-PAGE和Gelatin-Substrate-Active Tricine-SDS-PAGE及凝胶过滤高效液相色谱法,监测该重组Cystatin蛋白的分子降解情况.结果显示:重组0.18 mg/m L(即25 unit/m L)的Cystatin蛋白在4℃、p H=7.0条件下贮存15 d,活性几乎无损失且未发生降解,主要为Mr 20×103蛋白形式;17-21 d内逐步降解为Mr 14×103,但21 d时Cystatin抑制活性仍保持在80%以上;33 d时活性则迅速下降50%,Mr20×103的Cystatin蛋白完全降解,即液相检测图谱中峰2消失,有活性的Mr 14×103形式即峰3降解成低活性的Mr 12.55×103的峰3′,同时降解峰4、峰5、峰6即Mr 6.5×103、Mr 4×103左右的小肽片段比例快速升高,标志Cystatin明显失活.本研究表明,鲢鱼重组Cystatin蛋白在p H=7.0的液体环境中,4℃冷藏稳定性良好,活性及其完整性可保持约30 d.

鲢鱼纯鱼肉重组制品凝胶工艺研究

通过单因素试验和响应面设计法,确定谷氨酰胺转胺酶(TG)、氯化钠(NaCl)与酪蛋白酸钠(SC)的配合使用对鲢鱼纯鱼肉重组制品凝胶强度的最佳工艺条件为:TG酶添加量为0.9%,酪蛋白酸钠添加量为1.1%,NaCl添加量为1.8%,此时鲢鱼肉重组蛋白凝胶强度可达2 123.54 g×cm。