鲤春病毒血症病毒检测方法研究进展

鲤春病毒血症病毒(SVCV)会使鲤科鱼暴发鲤春病毒血症。该病传染性极强、死亡率极高,发现病鱼就要对其进行及时识别和扑杀(Ahne W等,2002)。鲤春病毒血症被世界动物卫生组织(OIE)列为一旦发现则必须向有关部门申报的疾病,被我国列为二类动物疫病(孙翰昌等,2020)。2018年国家市场监督管理总局发布的鲤春病毒血症诊断规程,规定了鲤春病毒血症的采样。

鲤春病毒血症病毒RT-RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种可现场快速准确检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法,本研究结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,根据SVCV L基因保守区域设计引物及探针,通过优化反应时间和温度等条件,初步建立了可用于SVCV现场可视化检测的RT-RAA-LFD方法。优化后的检测方法在35℃水浴锅中恒温反应15 min即可实现对SVCV目的基因片段的有效扩增。结果显示,该方法可以特异性的检测SVCV,并且不与病毒性出血败血症病毒、传染性鲑鱼贫血症病毒、病毒性神经坏死病毒等其他常见鱼类病毒发生交叉反应;对SVCV重组质粒标准品的检测限为2.42×10^(2)拷贝/μL,并具有较好的稳定性和重复性;采用该方法和病毒分离、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、荧光定量RT-RAA共5种方法同时对45份临床样品检测,其中病毒分离、套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR均检测到29份阳性样品,荧光定量RT-RAA和本研究建立的方法均检测到28份阳性样品,本研究与前3种方法的阳性符合率为97.8%,与荧光定量RT-RAA的阳性符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的SVCV RT-RAA-LFD检测方法简便快捷、特异性强、敏感性高、结果可靠,且不依赖于复杂的仪器,可适用于现场和实验室对SVCV的快速检测。

荧光RT-PCR检测鱼类鲤春病毒血症病毒的研究

本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术。同时,又将该方法与一步法RT-PCR方法和细胞查毒方法进行了互相验证和对比研究,结果表明,荧光RT-PCR方法检测病毒悬液的灵敏度最高,病毒悬液10-6稀释仍然可以检出,而细胞分离病毒方法测得的TCID50为10-4。本文还对北京地区出口渔场送检样品、人工实验感染该病毒鱼的病料进行了组织脏器中病毒分布和病毒含量的研究。结果显示,北京地区出口渔场送检样品未见细胞病变,所有检测样品均为阴性;病毒致死鱼的肠道病毒含量最高,肠组织研磨稀释10-4倍仍然可以检出;其次是肾和鳃组织,检出极限为稀释10-3倍组织悬液;肉和脑组织中病毒含量较低,肉最高能检出10-2倍组织悬液,而脑组织只能检出10-1倍组织稀释液。

鲤春病毒血症病毒(SVCV)的研究进展

鲤春病毒血症病毒(SVCV)是一种能够引起鲤科鱼类急性传染性病毒病-鲤春病毒血症(SVC)的病原,一旦暴发会造成巨大的经济损失。该病主要在欧洲的鲤鱼养殖中广泛传播,主要症状为体内出血,腹膜炎及腹水。SVCV具有囊膜,暂时列为弹状病毒科水泡性病毒属。病毒基因组为线性单股不分段的负链RNA,长11 019个核苷酸,主要包含5个基因,分别编码核蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M、糖蛋白G和RNA聚合酶L。目前,中国出入境检验检疫检测SVCV的行业标准是逆转录PCR法。本研究从病毒的生物学特征,感染的临床症状及流行特点,病毒基因组及其多肽特征,病毒的分类地位以及检测技术等方面对国内外研究的现状作一综述。

用RT-PCR法快速检测鲤春病毒血症病毒基因

用逆转录多聚酶链式反应 (RT PCR)方法快速、灵敏、特异地检测鲤春病毒血症病毒(SVCV) ,根据SVC病毒糖蛋白基因序列设计的引物经过RT PCR和半嵌套PCR(semi nested PCR)可扩增出SVC病毒核酸中的 71 4bp和 60 6bp片段。与其他弹状病毒IHNV、VHSV、PFRV没有交叉 ,具有特异性。灵敏度检测 ,表明不小于 1 0 0 0个病毒就可检测出阳性结果。本文还对复性温度 ,引物 ,Mg2 +,Tag酶以及反转录酶的浓度对检测结果的影响进行了探讨。

黑龙江地区鲤春病毒血症病毒的分离与基因型分析

对2015—2016年黑龙江不同地区的40个养殖场送检的鲤(Cyprinus carpio)进行鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)的细胞培养分离、PCR鉴定、病毒滴度测定、病毒表面糖蛋白(glycoprotein,G)氨基酸序列聚类分析及基因分型研究。细胞培养结果显示,来自4个不同养殖场的鲤组织样本能够感染鲤上皮细胞(epithelioma papulosum cyprini,EPC)产生典型细胞病变(cytopathic effect,CPE),收集病毒悬液分别称为Shlj1~Shlj4。PCR鉴定结果表明,该4株病毒均为SVCV。病毒滴度实验测算出SVCV Shlj 1~Shlj 4的滴度分别为10^(6.28)、10^(6.88)、10^(7.57)和106.38 TCID50/mL。Shlj的糖蛋白基因核苷酸序列的聚类分析和遗传进化分析结果显示,Shlj 1~Shlj 4与Gen Bank收录的中国参考株A2、BJ0505-2和美国参考株USA、212364聚为一簇,同源性为98.4%~99.8%;Shlj 1~Shlj 4毒株之间的糖蛋白核苷酸序列相似性在98.6%~99.8%,其中Shlj 3与美国SCVC毒株USA、212364具有最高的核苷酸相似性(99.8%),Shlj 2与英国参考毒株880163具有最低的相似性(88.0%)。糖蛋白氨基酸序列比对结果显示,Shlj4中氨基酸突变最多,与另3个毒株差异较大。基因型分析结果显示,Shlj 1~Shlj 4均为基因Ia型。本研究结果表明,黑龙江地区2015—2016年间的SVCV检出率约为10%,并且来源于不同养殖场的病毒分离株的核酸序列呈现不同程度的差异,该结果进一步证明SVCV毒株在中国不同的鲤养殖环境中正在不断地进化。

鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的初步表达

根据SVCV糖蛋白基因序列设计引物,在5’引物和3’引物中分别引入酶切位点。以病毒核酸为模板用RT-PCR方法扩增该段糖蛋白基因,将所得的基因片段(517和521)克隆至穿梭载体pGAPZαA/B之GAP启动子下游位点,构建含α信号肽的重组表达载体。获得的重组质粒pGAPZαA-517和pGAPZαB-521经线性化后,电击法转化毕赤酵母SMD1168菌株,构建分泌型表达SVCV糖蛋白的重组酵母菌株。酵母菌落PCR法检测表明,已成功构建分泌表达SVCV糖蛋白的酵母基因工程菌株,斑点印迹法进一步分析表明有目的蛋白的成功表达。

鲤春病毒血症病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立鲤春病毒血症病毒(SVCV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的SVCV N蛋白基因的保守性序列设计并合成特异性引物,建立了该病毒的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数为0.99,在102拷贝/μL^109拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。该方法对传染性脾肾坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、传染性皮下及组织坏死病毒和白斑综合征病毒其他水生动物病毒核酸扩增结果均为阴性,特异性强;该方法对SVCV检测下限为100.76 TCID50/m L,比常规PCR灵敏100倍;批内和批间的变异系数均小于7.6%,重复性好。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,对SVCV的快速检测及定量检测具有重要意义。

鲤春病毒血症病毒Shlj1株糖蛋白空间结构及其B细胞抗原表位的预测

为预测鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)Shlj1株糖蛋白(Glycoprotein,G)的空间结构及B细胞抗原表位,采用RT-PCR法从接种SVCV的鲤上皮细胞悬液提取的病毒总RNA中扩增糖蛋白基因,并通过序列测定获得Shlj1株糖蛋白基因的核苷酸序列及氨基酸序列,利用Phyre2对Shlj1分离株的糖蛋白空间结构进行预测,使用DNAStar软件综合分析糖蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性和抗原指数参数。结果表明:获得的SVCV Shlj1株糖蛋白核苷酸序列长1527 bp,推导出其氨基酸序列为509aa;空间结构预测显示,SVCV Shlj1株糖蛋白存在一定数量的α-螺旋、β-折叠、β-转角及大量无规则卷曲结构,空间构象较规则;抗原指数及抗原表位指数分析显示,糖蛋白中存在许多抗原指数较高的区域,该区域平均抗原指数为1.025,最大值达1.250,其中5个区域(4~26、145~157、293~302、315~327、407~491氨基酸区段)可能是B细胞抗原表位的主要分布区域。本研究结果为SVCV糖蛋白表位疫苗的设计及单克隆抗体的制备奠定了理论基础。

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的截短表达及其免疫原性分析

为了揭示鲤春病毒血症病毒（spring viremia of carp virus,SVCV）糖蛋白编码基因的主要免疫原性决定区域,本研究对SVCV的糖蛋白基因进行截短表达,并用纯化的重组蛋白作为免疫原制备了兔抗血清以分析其免疫原性。通过SOSUI以及DNAStar 6.0软件对SVCV糖蛋白基因的跨膜区、亲水性以及抗原表位进行分析后,采用RT-PCR对该基因主要抗原决定区域编码片段进行扩增,并构建重组表达质粒p GEX-Gtr,对其进行诱导表达后获得截短的SVCV糖蛋白的重组蛋白。将表达的重组蛋白进行纯化复性后,作为免疫原制备兔抗血清,采用ELISA法检测其效价,采用免疫印迹以及间接免疫荧光技术检测该重组蛋白的免疫原性。研究结果显示,截短表达的糖蛋白编码基因长1317 bp,编码439个氨基酸（29~467）,推测分子量为49.6 k D。利用该重组蛋白制备的兔抗血清,其与重组蛋白的反应效价为1∶64000,。免疫印迹及间接免疫荧光结果显示,该兔抗血清与SVCV-HN株能发生特异性反应,表明该重组蛋白与天然的病毒表面糖蛋白的免疫原性无差异。上述研究结果表明,截短表达的重组蛋白具有很好的免疫原性,可应用于免疫诊断技术研发与基因工程疫苗的研制。

数字RT-PCR检测鲤春病毒血症的方法建立与应用

[目的]通过实时定量RT-PCR和数字RT-PCR两种方法的比对试验,建立快速检测鲤春病毒血症的数字RT-PCR方法。[方法]利用同一对引物和探针,以梯度稀释的方法测定两种方法针对SVCV的灵敏性、特异性及重现性。[结果]两种方法均能够检测出104倍稀释的SVCV,而数字RT-PCR可以检测出单个微滴中的SVCV,其灵敏度性高于实时定量RT-PCR。同时,两种方法的特异性都很强,对其他病毒,如传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血败血病毒(VHSV)均未有扩增反应。两种方法的重现性也较好。[结论]数字RT-PCR方法比实时定量RT-PCR具有更高的灵敏度,在鲤春病毒血症的早期快速诊断方面具有重要作用。

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达纯化鲤春病毒血症病毒(SVCV)G蛋白,制备特异性单克隆抗体,扩增出鲤春病毒0504分离株G基因片段,并将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,经诱导表达、裂解离心包涵体,包涵体经His Bind亲和层析柱纯化及尿素浓度梯度复性后,作为抗原免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体。结果表明:成功筛选出2株稳定分泌G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1C5、2D5,经Western-Blot检测表明,制备的单克隆抗体具有良好的特异性。本研究中成功制备的抗G蛋白单克隆抗体,可为建立新型鲤春病毒检测方法提供工具。

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体制备及鉴定

为制备鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体(MAb),本研究用纯化的SVCV免疫BALB/c鼠,通过杂交瘤细胞技术,制备2株抗SVCV的MAb,分别命名为2A3和3H7。经间接ELISA检测腹水效价为1:10240和1:12150。亚类鉴定证实,这2株亚类均为IgG1型。经非竞争酶免疫试验测定2A3和3H7的抗体亲和力常数分别为4.86×108L/mol和1.86×109L/mol,3H7相对亲和力高于2A3。MAb 2A3和3H7的饱和度均为1:400,叠加试验所得增值指数为63.2%,大于50%。抗体反应增值结果表明:两株MAb分别针对不同抗原位点。免疫印迹分析检测表明,两株纯化的MAb均可与SVCV抗原发生特异反应。

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为获得针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)特异性的单克隆抗体(MAb),以纯化的SVCV为抗原,免疫BALB/c小鼠。将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选获得4个能稳定分泌抗SVCV MAb的杂交瘤细胞株;4个杂交瘤细胞制备腹水的MAb效价为1∶160000～1∶640000。亚型鉴定结果表明,这些MAb分属2个亚型(1F1、3E1,IgG2a;3F5、4F9,IgG1),轻链均为Κ链。Western blot分析显示,MAb1F1、3F5、4F9能特异性地识别SVCV的N蛋白(47ku),3E1能特异性地识别SVCV的G蛋白(69ku)。采用相加ELISA法对抗原表位分析结果显示,1F1、3F5、4F9可能识别相同的表位,3E1则识别不同的表位。间接免疫荧光试验结果显示4株MAb均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色。这些MAb的制备为SVCV免疫学检测方法的建立奠定了基础。

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的高效表达和纯化

本研究从鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus，SVCV）SVCV-741毒株克隆鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因（sue—g），将svc-g亚克隆到原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌E．coli BL-21（DE3）后，用IPTG诱导培养，获得菌体总蛋白。用SVCV毒株免疫山羊所得到的抗血清作为一抗进行免疫印迹实验，结果在硝酸纤维素滤膜上检测到50～71 kDa之间的特异性免疫条带，与SVCV糖蛋白预测分子量一致，研究证明了工程茵表达获得的重组蛋白具有与SVCV毒株相同的免疫原性，也证明了该蛋白的糖基化对其免疫表位是非必需的。本研究进一步通过发酵基因工程菌和蛋白质纯化过程，获得大量的鲤春病毒血症病毒糖蛋白，为后期免疫动物获得抗血清储备了原料，也为SVCV的免疫学检测方法的建立奠定了物质基础。

鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。

流式细胞仪在快速测定鲤春病毒血症病毒滴度中的应用

本研究建立了流式细胞仪快速检测鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus,SVCV)滴度的方法。运用荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting,FACS)技术检测SVCV A1株对草鱼性腺细胞系(GCO)的感染情况。用SVCV病毒单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠抗体为二抗,运用FACS来检测感染后不同时间点,以及不同病毒接种量的阳性细胞率。感染第3天时为最佳的病毒滴度测定时间点,测得SVCV的病毒滴度为8.31×105 FIU/m L,最低检测病毒滴度为(1000 FIU/m L),与传统空斑试验(plaque assay,PA)相比,两种方法测得的结果基本一致。实验结果表明,FACS是一种简捷、高效、直接的检测SVCV滴度的方法,是一种新型的病毒滴度测定方法。

鲤春病毒血症病毒G蛋白的研究进展

鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)是引起鱼类传染性病毒病鲤春病毒血症(Spring viremia of carp,SVC)的病原,对鲤科鱼类养殖业造成巨大的经济损失。囊膜糖蛋白G可介导病毒内吞,还是最主要的抗原决定簇蛋白,已成为国内外研究的热点。综述G蛋白在表达技术、病毒检测、疫苗研制等方面的研究状况,旨在为G蛋白的深入研究及鲤春病毒血症的防治提供参考。

鲤春病毒血症病毒核酸适配体的筛选及分析

核酸适配体(Aptamer)是一类单链短DNA或RNA片段,具有一定的空间结构,对特定靶分子具有亲和力。本研究采用指数富集配体系统进化技术(SELEX),首次筛选出针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)的核酸适配体A2和A15,经过荧光PCR、凝胶阻滞和病毒中和实验,证明了其对SVCV具有结合力和抑制作用,在该病的检测和防治方面具有良好的前景。

鲤春病毒血症病毒糖蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

本实验利用杆状病毒表达系统表达鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白。将SVCV糖蛋白基因(G)插入到供体质粒pFastBacHTA中,再用构建的质粒pFastBac-G转化E.coli DH10αBac感受态细胞,经蓝白斑筛选,获得含G基因的重组穿梭载体Bacmid-G。通过脂质体介导将Bacmid-G转染对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒AcNPV-G。AcNPV-G感染Sf9细胞,超声破碎后离心取上清进行SDS-PAGE及Western Blot试验,结果可见大小约为57 kDa的蛋白条带,并与羊抗SVCV血清发生特异性反应。间接免疫荧光试验在感染AcNPV-G的Sf9细胞中观察到荧光信号。试验结果表明,AcNPV-G在Sf9细胞中成功的表达了SVCV糖蛋白,且具有良好的免疫学活性。