四川地区养殖锦鲤浮肿病毒检测与系统进化分析

2017年10月,四川省某锦鲤养殖场暴发一种以嗜睡、腹部肿大、鳃肿胀和眼睛凹陷为临床特征的传染病,累计死亡率高达50%。为研究锦鲤发病病因和疾病流行规律,对病鱼解剖,进行病理组织观察、电镜观察、PCR检测和系统进化分析。结果显示,患病锦鲤眼球浑浊,腹部肿大,鳃肿胀严重;组织病理学观察发现病鱼的鳃、肝脏、肾脏和脑组织细胞变性、坏死,出现大量炎性细胞浸润;透射电镜观察,在肾脏组织中发现病毒粒子。巢氏PCR方法检测鲤浮肿病毒(carp edema virus,CEV),出现特异性扩增产物;基于CEV P4a基因进行系统发育分析,此病毒与英国株R083同源性为99%。本研究为鲤浮肿病毒的起源进化、分类、疾病诊断和防控提供重要依据。

鲤浮肿病病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

本研究针对鲤浮肿病病毒(carp edema virus,CEV)基因组核蛋白编码基因P4a的序列,设计2对特异性引物,以克隆构建的重组质粒为标准模板,通过优化反应体系中引物浓度组合、Mg2+浓度、dNTPs浓度、反应温度和扩增时间等参数,建立了CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。结果表明,CEV-LAMP方法的最佳反应温度为62℃,引物浓度组合为引物F3/B3 0.2μmol/L,引物FIP/BIP 1.2μmol/L,Betaine 0.7 mol/L,Mg2+8.0 mmol/L,dNTPs 1.2 mmol/L,反应时间60 min。反应产物经凝胶电泳呈现梯型条带,添加SYBR Green I荧光染料后,呈现明显的绿色阳性反应。CEV-LAMP法灵敏度高,最低检测限为10 copies/μL,较常规PCR法灵敏度高100倍;CEV-LAMP法特异性强,与锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)无交叉反应。CEV-LAMP应用于患病鲤样本检测结果准确,简便快速,可为鲤浮肿病的现场诊断与防控提供技术支撑。

养殖鲤和锦鲤中的鲤浮肿病毒检测与分析

鲤浮肿病毒(carp edema virus,CEV)是一种严重危害养殖鲤和锦鲤的病毒。2014年在北京地区确诊的首例鲤浮肿病意味着该病已进入中国。为调查CEV在养殖鲤、锦鲤中的流行现状,同时筛选适宜的CEV普查方法,探索其发病条件,试验于2016年5月至2016年9月共采集13个样品,采用日本学者建立的Nest-PCR法及英国学者研究的Nest-PCR法、Real-time PCR法进行CEV检测。结果发现,13个样品中共检测到5个CEV阳性,3个为锦鲤样品,2个为普通鲤或杂交鲤样品。Real-time PCR法检出所有阳性,日本的Nest-PCR法检出3个锦鲤阳性和1个普通鲤阳性,英国的Nest-PCR法仅检出3个锦鲤阳性。在阳性样品中,3号和10号样品的养殖鱼并未发病死亡,且3号样品鱼体内的病毒拷贝数高于有临床症状并出现死亡的7号、8号和13号样品。说明目前养殖鲤、锦鲤的CEV阳性率较高,亟需加强该病毒的监测、防控。英国学者建立的Real-time PCR法不会漏检,更适合用于中国CEV的监测普查。没有外界环境条件刺激,养殖鱼即使感染CEV或CEV在其体内增殖,也不一定发生鲤浮肿病。结合鲤浮肿病发病温度范围较宽,提示环境条件刺激才是导致该病发生的关键因素,避免环境刺激是降低该病发生的一个有效措施。

鲤浮肿病研究进展

鲤浮肿病(Carp edema virus disease,CEVD),也称锦鲤昏睡病(koi sleepy disease,KSD),是一种严重危害鲤和锦鲤养殖的病毒病。本文对鲤浮肿病的病原生物学特征、临床症状、易感品种、发病条件、传播方式、分布范围、分子流行病学、病毒检测方法、防控措施等,进行了阐述和介绍,旨在为该病的预防与控制提供参考。

鲤浮肿病检测方法实验室间比对的结果与评价

鲤浮肿病(carp edema virus disease,CEVD)是在锦鲤中发现的一种传染性病毒病,近年来在全球传播迅速,对鲤养殖业造成严重损害。本研究设计CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,进行特异性实验;选取套式PCR、荧光PCR和LAMP三种检测方法,组织10家实验室进行室间比对测试:制备含CEV病毒核酸的测试样品,评价其均匀性和稳定性,通过测试结果分析方法检出限。结果显示,套式PCR的核酸样品检测限可达6.8×10^(-10) g。

天津地区养殖鲤鱼(Cyprinus carpio)鲤浮肿病毒(CEV)PCR检测与人工感染试验

对2015—2016年天津地区鲤鱼养殖场采集的发生鲤浮肿病毒(CEV)/锦鲤睡眠病(KSD)的鲤鱼样品,进行套式PCR检测和人工浸泡感染试验,并测定养成期鲤鱼感染率。实验观察研究发现,所采集样品均表现为体色发黑,头部上方颅骨软组织周围皱缩,眼球凹陷,鳃粘脏,黏液较多,常滞游于浅水区水面。套式PCR检测结果显示全部10个样品均出现特异性目的条带,为CEV阳性。目的产物测序后经NCBI BLAST,与已报道的CEV相关序列相似性介于85%—99%;系统发育树分析显示样品编号JY1856与JY1650位于同一分支,与已知CEV病毒株亲缘关系较近,而其余8个样品位于同一分支,与已知CEV病毒株亲缘关系较远。通过人工浸泡感染健康鲤鱼,半数致死时间为55d,累计死亡率为71.1%±3.2%,并从试验感染鱼组织中检测到CEV病毒DNA。养成期鲤鱼CEV携带率为77.5%。以上结果表明,天津地区养殖鲤鱼中存在CEV感染,揭示了我国鲤鱼养殖产业可能面临新的疫情,需引起养殖业的高度重视。

2020年河北省锦鲤疱疹病毒病、鲤浮肿病调查报告

为了解河北省锦鲤疱疹病毒病(KHVD)、鲤浮肿病(CEVD)发病情况,采用国家及省级专项监测与实地调查相结合的办法进行调查。结果显示,KHVD、CEVD在河北省发病均呈上升趋势,尤其是鲤浮肿病发病面积与发病死亡率与上一年相比均有所增加,造成的损失较大。

2018年河北省鲤浮肿病流行情况调查

为了解鲤浮肿病流行情况,对河北省鲤浮肿病或疑似鲤浮肿病进行了监测与调查。结果显示,引种与横向污染是鲤浮肿病病原的主要来源,区域性发病具有连续性,并有扩散趋势,应引起养殖单位高度关注。

鲤浮肿病的诊断与防控

2018年9月初,贵州黔东南州某地的池塘鲤和稻田鲤发生了疑似鲤浮肿病,死亡率达80%,造成养殖户损失30多万元。为了确诊病因,采集病鱼后送往省外的疫病实验室检测,检测结果是锦鲤疱疹病毒和鲤疱疹病毒Ⅱ型为阴性,鲤浮肿病毒为阳性,再结合临床症状确诊为鲤浮肿病毒引起的鲤浮肿病。本文介绍了这起鲤浮肿病的发病情况、临床症状、诊断经过、病因分析以及具体防控措施。目前,鲤浮肿病没有有效的治疗方法,只能是预防控制为主,应加强池塘和稻田的管理,发病期间停止使用药物,停止换水保持水体环境稳定,停止投喂饲料,对池塘开增氧机增氧等。

2021年河北省鲤浮肿病调查报告

2021年对河北省鲤浮肿病发病及流行病学情况进行调查,根据调查结果,对比2017—2020年调查数据,分析得出,CEVD在河北省发病情况仍较严重,造成的经济损失依然较大;区域性发病仍具有连续性;因引种等原因造成点状发病有扩散趋势,应引起养殖单位高度关注。

鲤浮肿病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

为了给鲤浮肿病(carp edema virus disease,CEVD)的防控提供特异、灵敏、快速的检测方法,针对鲤浮肿病毒(carp edema virus,CEV)的P4a基因序列设计5条特异性引物,建立CEV的环介导等温扩增检测方法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。结果表明该方法具有很高的特异性。最低可检出6 000拷贝/μL,检测灵敏度与Real-time PCR方法相当。对30个鲤及锦鲤养殖场样品进行检测并与Real-time PCR方法进行比较,该方法的检测结果符合率达到96.7%以上。本方法的建立及应用为CEVD的防控提供依据。

鲤浮肿病的发展态势及挑战

水产养殖及观赏鱼类一直是食品消费和美学赏鉴不可分割的一部分,近年来,为满足不断增长的水产品需求,各国之间的鱼类销售贸易规模逐渐扩大,这是导致鱼类病毒扩散的重要原因之一。目前,鲤浮肿病作为一种新型传染病,给水产养殖业特别是鲤鱼养殖业带来巨大损失,其致死率达到80%~100%。本文从鲤浮肿病的研究背景、检测方法、预防与治疗手段及所面临的挑战等方面进行探讨,以提高监测人员、检测人员及相关水生法规立法工作人员对鲤浮肿病的认识。