鲤疱疹病毒二型(CyHV-Ⅱ)疫苗研究进展

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-Ⅱ)对任何发育时期的金鱼、鲫鱼及其杂交品种均具有感染能力,能够引起金鱼疱疹病(goldfish haematopoietic necrosis, GFHN),是一种传染性强且死亡率极高的疫病,给我国金鱼和鲫鱼养殖业造成巨大经济损失,鱼用疫苗的研发是预防和治疗该疫病最有效的办法。综述了CyHV-Ⅱ灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、活载体疫苗和纳米递送疫苗的研究进展,并对鱼用疫苗纳米材料的应用前景进行了探讨,以期为金鱼疱疹病害防治和鱼用疫苗研究提供新技术方法和新思路策略。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72单克隆抗体的制备及应用

鲤疱疹病毒Ⅱ型是引起鲫造血器官坏死病的重要病原。为建立基于抗原水平的免疫检测方法,通过原核表达方法制备鲤疱疹病毒Ⅱ型核衣壳蛋白ORF72,将纯化的ORF72蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术筛选获得单克隆抗体1B3、4B1、4C2、5F4和5H9。免疫印迹分析显示,上述5株单抗均可特异性识别重组蛋白ORF72;免疫荧光分析显示,仅单抗4C2可与感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的鲫脾脏发生阳性反应。利用单抗4C2通过间接免疫荧光技术对鲤疱疹病毒Ⅱ型感染鎏金金鱼鳍条细胞系(RyuF-2)后ORF72蛋白表达情况进行检测,结果显示,感染后36 h可检测到阳性信号,并且随着感染时间的延长,细胞中ORF72的表达量明显增加。本试验制备的单克隆抗体4C2为体外进一步探究鲤疱疹病毒Ⅱ型在细胞内的复制机制及建立病鱼免疫检测手段奠定了基础。

转录因子NF-κB对鲤疱疹病毒Ⅱ型基因启动子的表达调控研究

为深入探究NF-κB信号通路对CyHV-2感染过程的影响,在CyHV-2感染的GiCF细胞中加入NF-κB激动剂,通过RT-qPCR和Western Blot分析在感染24、72、96 h后CyHV-2编码基因在转录和翻译水平的表达情况。结果显示,在加入NF-κB激动剂后的72、96 h,CyHV-2编码基因转录和翻译水平均明显高于对照组,提示NF-κB促进CyHV-2编码基因的转录及翻译。为进一步阐明NF-κB如何影响CyHV-2的转录和翻译,利用生物信息学软件预测CyHV-2部分编码基因的启动子序列中和NF-κB的结合位点,采用双荧光素酶报告基因实验分析NF-κB对启动子活性的影响。结果表明,NF-κB过表达提高了病毒基因启动子活性,提示NF-κB可以通过促进CyHV-2基因的启动子活性来增强病毒复制水平。研究结果有助深入探究CyHV-2基因的表达翻译机制,也为开发基于NF-κB信号通路靶点的新的抗病毒抑制剂提供理论支撑。

感染鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)的异育银鲫血液生理生化指标及相应组织学变化

于江苏大丰金鹿合作社采集三种状态的异育银鲫Carassius auratus gibelio样本,试验1组(H)来自未发生过鲤疱疹病毒(Cy HV-2)病的2个池塘(面积200×667m2),即为无Cy HV-2病症状的病毒携带者;试验2组(IH)和试验3组(I)为正在发病的2个池塘(面积200×667m2),IH组有轻微的Cy HV-2病症状,而I组为典型的Cy HV-2病症状,测定其血成分、血清生化指标,并观察肠道和肝胰脏的组织病理学,以探讨异育银鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)的发病机制。结果表明:IH组和I组鲫除淋巴细胞百分比显著升高外(P<0.05),中性粒细胞和单核细胞百分比、红细胞和血栓细胞数、血红蛋白、血栓细胞压积均显著低于H组(P<0.05);I组淋巴细胞百分比显著高于IH组(P<0.05),而中性粒细胞百分比却显著低于IH组(P<0.05),其他各项指标无显著差异。IH组和I组除天门冬氨酸基转移酶/丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、白球比例比H组显著升高外(P<0.05),胆碱酯酶和碱性磷酸酶活性、总胆汁酸、甘油三酯、高密度脂蛋白/低密度脂蛋白均显著下降(P<0.05)。I组与IH组结果比较,天门冬氨酸基转移酶、天门冬氨酸基转移酶/丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、白球比例均出现显著升高(P<0.05),而胆碱酯酶、碱性磷酸酶出现显著下降(P<0.05),总胆汁酸含量下降了38倍,下降明显,其他均无显著变化。扫描电镜观察发现,H组红细胞表面光滑完整,IH和I组均有一定的损伤;相比H组,IH组、I组的肝胰脏和肠道的组织结构损伤,且随着患病严重性的增加而加重。

鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2) ORF25蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

利用PCR方法扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)ORF25基因的部分基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG,成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达,分子质量大小为42ku,且主要以包涵体形式存在;用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,多次免疫后通过细胞融合,筛选出1株单抗5C6;经间接免疫荧光试验和Western blot试验验证,这株单抗可以识别CyHV-2ORF25蛋白。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66截短蛋白多克隆抗体的制备及互作多肽筛选

为深入探究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在感染过程中的生物学功能,构建了ORF66截短基因的原核表达质粒pET28a-tORF66,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside)16℃诱导蛋白表达,经尿素溶解透析获得溶解的重组蛋白后免疫6周龄小鼠,制备鼠抗tORF66多克隆抗体。将纯化后重组蛋白进行噬菌体展示以此来筛选互作蛋白。经Western Blot检测显示,抗体能够识别感染鲫鳍条细胞系GICF细胞中的鲤疱疹病毒Ⅱ型,效价较高,特异性较好。噬菌体淘选结果通过生物信息学分析显示,得到一条出现频次最高的多肽N′-LHLHQNRMSLSR-C′。该多肽与金鱼基因组中的3个基因有较高的同源性,推断其可能与rORF66重组蛋白相互作用。这将为深入探究ORF66在CyHV-2病毒感染过程中的生物学功能、开发抗CyHV-2病毒新药物及寻找潜在的药物靶点提供新依据。

鲤疱疹病毒2型ORF144原核表达和多克隆抗体制备

鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)引起的鲫造血器官坏死病是近年来对鲫(Carassius carassius)养殖业危害最大的疾病之一。通过PCR扩增得到ORF144基因全长,将其与pET-32a原核表达载体连接构建重组载体pET-ORF144,转化到大肠杆菌中,经IPTG诱导表达得到大小约46 kDa的重组蛋白,该蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在。将重组融合蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,间接ELISA检测显示抗体效价大于1∶51200。经Western Blot验证该抗体可特异性识别感染CyHV-2的细胞中的蛋白质和纯化的融合蛋白。间接免疫荧光结果显示该蛋白定位于细胞质,呈点状分布。结果表明构建的ORF144多克隆抗体可为病毒的基因功能和致病机制研究提供基础。

养殖鲫鲤疱疹病毒2型的鉴定及病毒囊膜蛋白ORF131多抗的制备

为了解鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在南京地区养殖场鲫鱼中的发病情况,对南京某渔场疑似CyHV-2感染鱼,采集鳃、肾脏等组织进行解旋酶基因(hel)PCR扩增测序及遗传变异分析;通过蔗糖密度梯度离心从发病鲫鱼组织中提纯病毒粒子,电镜观察其形态;对CyHV-2的10种囊膜蛋白编码基因进行测序,并基于生物信息学分析选择理想的囊膜蛋白进行原核表达,免疫小鼠制备抗血清。结果显示:患鱼组织hel基因检测阳性,其序列与参考株ST-J1毒株hel基因序列(GenBank登录号:JQ85364)高度同源(99.67%),并位于同一进化分支;利用蔗糖密度梯度离心结合Western blot检测发现,病毒粒子存在于40%~46%蔗糖层,电镜观察显示直径在160 nm左右;10种囊膜蛋白中开放阅读框131(ORF131)囊膜蛋白具有一段连续B细胞表位且抗原性良好,将ORF131原核表达、免疫小鼠后制备的抗血清ELISA效价达1∶4000。本研究为南京地区CyHV-2感染的检测和防控提供了依据。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25截短蛋白的多克隆抗体制备与免疫原性分析

鲫(Carassius auratus)造血器官坏死症是我国养殖鲫中新出现的一种传染性病毒性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2),为研制针对该病的有效诊断试剂和疫苗,分析了Cy HV-2 ORF25基因编码蛋白的抗原表位,利用原核表达系统对Cy HV-2 ORF25编码蛋白富含抗原表位的区域进行截短表达,制备了抗Cy HV-2 ORF25编码蛋白的多克隆抗体,通过间接免疫荧光和免疫保护力测定等实验研究了截短表达蛋白的免疫原性。结果显示,原核表达的截短蛋白t ORF25分子质量约为28 k W,蛋白纯化后免疫日本大耳兔制备的多克隆抗体可特异性识别在Gi CB上增殖的Cy HV-2。将截短表达蛋白t ORF25免疫异育银鲫后,感染Cy HV-2,其相对免疫保护率达47%。

鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)灭活疫苗制备及其免疫效力测定

鲫造血器官坏死病是由鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)引起的危害我国养殖鲫鱼(Carassius auratus)最严重的病毒性疾病。为制备有效预防鲫造血器官坏死病的灭活疫苗,以CyHV-2代表流行株CNDF-TB2015为疫苗株,以CSC细胞系进行病毒增殖,并采用不同浓度的病毒对不同规格鲫鱼进行攻毒,建立攻毒模型。结果表明,培养的病毒滴度达10^(10)TCID_(50)/mL,以4×10^(7)TCID_(50)/尾的剂量腹腔注射感染体重300 g的鲫鱼可造成100%的死亡率。对病毒灭活剂甲醛、β-丙内酯和BEI灭活条件进行筛选优化,对疫苗免疫佐剂763A、IMS1312、铝胶和M402进行筛选,结果表明,浓度为10^(8.3) TCID_(50)/mL的病毒液最佳灭活条件为终浓度10 mmol/L的BEI 37℃灭活72 h,疫苗制备最佳佐剂为水佐剂IMS1312。对灭活疫苗的最小免疫剂量、最佳免疫剂量和有效免疫产生期进行测定,结果表明,要获得70%以上保护率的最小免疫剂量为8×10^(6)TCID_(50)/尾,最佳免疫剂量为4×10^(7)TCID_(50)/尾,在免疫4周后保护率可达80%,5周后保护率达到100%。制备的灭活疫苗为鲫造血器官坏死病的免疫预防提供了有力手段,也为其他水产动物病毒灭活疫苗的制备提供了借鉴。

鲤疱疹病毒2型不同分离株的基因组比较分析

从流行病学和病原学方面简述了鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2),对感染CyHV-2的金鱼、鲫的状态进行了比较。通过GenBank数据库查找,显示CyHV-2完整基因序列有7株,虽然这7株的基因组具有很高的同源性,但是不同的分离株在其基因组中包含很多突变、插入、缺失和重排。CyHV-2基因组约含150个ORF,其中部分ORF的功能在病毒感染过程中起重要作用。CyHV-2是一种具有高度传染性的病原体,主要感染金鱼、鲫及其变种,严重危害金鱼和异育银鲫养殖业发展。指出,应以CyHV-2的基因组序列为基础,加强对CyHV-2的基因功能以及宿主对CyHV-2的免疫反应等基础研究,以获得更有效地预防、控制和治疗方法,遏制其病毒的传播扩散。

鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定

采用细胞培养、超薄切片电镜观察、巢式PCR检测以及病毒DNA克隆与测序分析等技术。从湖北武汉一循环水养殖系统中患出血病异育银鲫（Carassius auratusgibelio）体内分离鉴定了一株鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2）病毒，命名为鲤疱疹病毒2型武汉株（CyHV-2．WH）。患病鱼组织匀浆液接种锦鲤鳍条细胞系（Koi．Fin）可产生典型的细胞病变效应。用患病鱼组织匀浆液与细胞培养物分别人工感染异育银鲫，均可重复出与自然发病相同的症状，死亡率达100％。患病鱼脾与肾脏组织超薄切片电镜观察结果显示，病毒为具囊膜的球形病毒，囊膜直径为170-200am，病毒衣壳直径为110～120nm，病毒在细胞核内复制、组装。采用CyHV-2的特异引物对病鱼样本和感染细胞培养物样本进行巢式PCR检测，均能扩增出357bp的目的条带，将该扩增产物进行测序与比对分析后发现，其与GenBank中已报道的CyHV-2毒株的DNA解旋酶基因高度同源（99．44％以上）。与鲤疱疹病毒3型（CyHV-3）也有较高的同源性（81．55％）。系统进化分析结果显示，CyHV-2．WH株与JS2012、H．Fukuda、YCll0907等CyHV-2病毒株属同一分支。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72基因克隆、蛋白原核表达和抗体制备

异育银鲫作为我国重要的淡水经济鱼类,其鳃出血病为主要病害,并造成重大经济损失,该病病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-2).目前,研究主要在该病的检测和病理方面,对于免疫学检测方面研究较少.本研究根据CyHV-2ORF72基因序列设计了1对特异性引物,利用患病异育银鲫肾脏DNA作为模板,通过PCR扩增得到CyHV-2ORF72基因全长,该基因序列全长为1113bp,可编码370个氨基酸的蛋白.该基因与pET-28a表达载体连接构建重组原核表达载体pET-ORF72转入大肠杆菌中,经IPTG诱导表达得到了分子量约为45ku的重组蛋白,与预测的蛋白大小基本一致.将纯化的重组蛋白皮下多点注射免疫新西兰大耳兔制备了ORF72的多克隆抗体,经Western Blotting检测抗体能与病毒粗提液有良好反应,特异性较好,本结果可为下一步建立疫苗和免疫检测方法奠定基础.

鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用

针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹病毒Ⅱ型,而对大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)以及空白对照无检测信号。取江苏射阳和宝应两地疑似患病鲫组织核酸作为模板进行荧光定量PCR,结果表明反应体系中的病毒量分别为6.89×104copies/μL和3.02×102copies/μL。本研究建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对因鲤疱疹病毒Ⅱ感染引起的养殖鲫造血器官坏死症的诊断与病毒病原定量检测有重要意义。

异育银鲫造血器官坏死症病鱼体内鲤疱疹病毒Ⅱ型的电镜观察与超微病理学特征

为分析患鲫造血器官坏死症异育银鲫Carassius auratus gibelio体内不同器官组织中鲤疱疹病毒（CyHV-2）粒子的形态结构、分布和发生过程,采集患病异育银鲫体肾、脾脏、头肾、肝胰脏、肠道、鳃各组织样本,利用透射电镜观察疱疹病毒和组织细胞超微病理学。在所采集器官组织中均观察到鲤疱疹病毒Ⅱ型的DNA内核、空衣壳、实心核衣壳、含包膜成熟病毒共4种不同成熟时期的病毒粒子,不同时期的病毒粒子直径分别为65-90nm、90-180nm、90-180nm、170-220nm;体肾和脾脏中含有大量的Cy HV-2病毒,而头肾、肝胰脏、肠道和鳃中病毒粒子较少;CyHV-2病毒主要感染体肾、头肾、脾脏的吞噬细胞,导致机体免疫机能改变;组织细胞病理学观察发现吞噬细胞核边缘化,核内染色质变性,核膜溶解,线粒体嵴断裂,出现空泡,个别细胞溶解坏死。通过PCR检测和电镜观察病毒粒子结构特征,确诊异育银鲫感染Cy HV-2病毒,主要器官组织细胞中均有CyHV-2病毒,且在细胞核中完成复制和组装,在细胞质中获得外膜。感染Cy HV-2病毒的异育银鲫主要器官组织均受到一定的损伤。

鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生

为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程,利用新建立的对Cy HV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系(Gi CB),对Cy HV-2的理化及生物学特性进行了详细研究,比较了不同来源鱼类细胞系对Cy HV-2感染的敏感性,并对体外培养细胞中Cy HV-2病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察。结果显示,Cy HV-2对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感;常用鱼类细胞系EPC、RTG-2、Koi-Fin、CIK、CCK、PF-Fin对Cy HV-2的感染不敏感,特异性巢式PCR检测盲传至第7代Cy HV-2细胞培养物,结果均为阴性;Cy HV-2在Gi CB细胞中的增殖动态研究结果表明:病毒感染细胞经过12 h的隐晦期,24 h开始进入对数生长期,96 h病毒滴度达到最高值(107.52±0.26 TCID50/m L),然后进入平台期;透射电子显微镜观察结果显示,Cy HV-2感染细胞可分为吸附与侵入、复制与装配、成熟与释放3个主要过程,病毒进入对数生长期后,被感染细胞内可见形态典型的疱疹病毒颗粒。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法

根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。

鲤疱疹病毒Ⅱ型对异育银鲫背鳍细胞的显微形态与免疫基因表达水平的影响

为研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)体外感染复制特征以及异育银鲫抗病毒免疫应答反应。本实验采用组织块培养法建立了异育银鲫背鳍细胞的原代培养体系。结果显示,在10 d左右可观察到组织块迁移分离出新的单层细胞,3周左右细胞可覆盖底部面积为25cm2培养瓶的底部;经Cy HV-2悬液感染离体培养的原代细胞,3 d后病毒滴度增殖至106拷贝/m L;在病毒感染6 d后出现典型的细胞病变效应;Cy HV-2感染原代细胞后,分析前期通过鱼体水平实验鉴定出的与该病毒感染相关的免疫基因:PNP5a、MPO、MHCⅠ、LYZ-C、IL-11、ITLN、PNP5a和DUSP,Real-time Rt-PCR结果显示大部分基因在细胞水平均有显著性的上调,与鱼体水平实验结果一致。本研究建立了原代培养的异育银鲫背鳍细胞,用于构建体外感染Cy HV-2病毒的细胞模型,为深入研究Cy HV-2的感染复制规律及其与宿主的相互作用关系,以及细胞水平筛选抗病毒药物实验奠定了基础。

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制中的作用

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量(TCID50),以及观察感染细胞的细胞病变效应(CPE)等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与ERK通路的关系.结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础.

Ⅱ型单纯疱疹病毒培养及gG-2基因特异片段的克隆

目的:通过培养和扩增Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)并提取其全基因组,从而克隆包膜糖蛋白gG-2全长基因及其保守性较高、抗原性较强的特异片段。方法:将HSV-2病毒感染Hela细胞获得大量病毒液,用酚-氯仿法提取病毒全长基因组,并以此为模板扩增编码gG-2的US4基因,再根据氨基酸序列比对结果,选取其特异片段,设计带酶切位点的引物克隆gG-2基因特异片段。结果:成功地获得了大量HSV-2病毒液并提取了病毒基因组,克隆了gG-2全长基因以及特异片段,测序证实,两者均与GenBank中报道的序列相一致。结论:对于遗传特性相对稳定的HSV-2来说,通过病毒感染细胞的方法短时期内获得大量病毒液,并从病毒全基因组中克隆gG-2特异基因片段的方法是可行的,从而为进一步构建gG-2特异片段相关载体、表达相应蛋白奠定了基础。