鲤疱疹病毒二型(CyHV-Ⅱ)疫苗研究进展

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-Ⅱ)对任何发育时期的金鱼、鲫鱼及其杂交品种均具有感染能力,能够引起金鱼疱疹病(goldfish haematopoietic necrosis, GFHN),是一种传染性强且死亡率极高的疫病,给我国金鱼和鲫鱼养殖业造成巨大经济损失,鱼用疫苗的研发是预防和治疗该疫病最有效的办法。综述了CyHV-Ⅱ灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、活载体疫苗和纳米递送疫苗的研究进展,并对鱼用疫苗纳米材料的应用前景进行了探讨,以期为金鱼疱疹病害防治和鱼用疫苗研究提供新技术方法和新思路策略。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66截短蛋白多克隆抗体的制备及互作多肽筛选

为深入探究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在感染过程中的生物学功能,构建了ORF66截短基因的原核表达质粒pET28a-tORF66,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside)16℃诱导蛋白表达,经尿素溶解透析获得溶解的重组蛋白后免疫6周龄小鼠,制备鼠抗tORF66多克隆抗体。将纯化后重组蛋白进行噬菌体展示以此来筛选互作蛋白。经Western Blot检测显示,抗体能够识别感染鲫鳍条细胞系GICF细胞中的鲤疱疹病毒Ⅱ型,效价较高,特异性较好。噬菌体淘选结果通过生物信息学分析显示,得到一条出现频次最高的多肽N′-LHLHQNRMSLSR-C′。该多肽与金鱼基因组中的3个基因有较高的同源性,推断其可能与rORF66重组蛋白相互作用。这将为深入探究ORF66在CyHV-2病毒感染过程中的生物学功能、开发抗CyHV-2病毒新药物及寻找潜在的药物靶点提供新依据。

感染鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)的异育银鲫血液生理生化指标及相应组织学变化

于江苏大丰金鹿合作社采集三种状态的异育银鲫Carassius auratus gibelio样本,试验1组(H)来自未发生过鲤疱疹病毒(Cy HV-2)病的2个池塘(面积200×667m2),即为无Cy HV-2病症状的病毒携带者;试验2组(IH)和试验3组(I)为正在发病的2个池塘(面积200×667m2),IH组有轻微的Cy HV-2病症状,而I组为典型的Cy HV-2病症状,测定其血成分、血清生化指标,并观察肠道和肝胰脏的组织病理学,以探讨异育银鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)的发病机制。结果表明:IH组和I组鲫除淋巴细胞百分比显著升高外(P<0.05),中性粒细胞和单核细胞百分比、红细胞和血栓细胞数、血红蛋白、血栓细胞压积均显著低于H组(P<0.05);I组淋巴细胞百分比显著高于IH组(P<0.05),而中性粒细胞百分比却显著低于IH组(P<0.05),其他各项指标无显著差异。IH组和I组除天门冬氨酸基转移酶/丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、白球比例比H组显著升高外(P<0.05),胆碱酯酶和碱性磷酸酶活性、总胆汁酸、甘油三酯、高密度脂蛋白/低密度脂蛋白均显著下降(P<0.05)。I组与IH组结果比较,天门冬氨酸基转移酶、天门冬氨酸基转移酶/丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、白球比例均出现显著升高(P<0.05),而胆碱酯酶、碱性磷酸酶出现显著下降(P<0.05),总胆汁酸含量下降了38倍,下降明显,其他均无显著变化。扫描电镜观察发现,H组红细胞表面光滑完整,IH和I组均有一定的损伤;相比H组,IH组、I组的肝胰脏和肠道的组织结构损伤,且随着患病严重性的增加而加重。

鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2) ORF25蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

利用PCR方法扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)ORF25基因的部分基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG,成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达,分子质量大小为42ku,且主要以包涵体形式存在;用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,多次免疫后通过细胞融合,筛选出1株单抗5C6;经间接免疫荧光试验和Western blot试验验证,这株单抗可以识别CyHV-2ORF25蛋白。

鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用

针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹病毒Ⅱ型,而对大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)以及空白对照无检测信号。取江苏射阳和宝应两地疑似患病鲫组织核酸作为模板进行荧光定量PCR,结果表明反应体系中的病毒量分别为6.89×104copies/μL和3.02×102copies/μL。本研究建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对因鲤疱疹病毒Ⅱ感染引起的养殖鲫造血器官坏死症的诊断与病毒病原定量检测有重要意义。

鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生

为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程,利用新建立的对Cy HV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系(Gi CB),对Cy HV-2的理化及生物学特性进行了详细研究,比较了不同来源鱼类细胞系对Cy HV-2感染的敏感性,并对体外培养细胞中Cy HV-2病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察。结果显示,Cy HV-2对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感;常用鱼类细胞系EPC、RTG-2、Koi-Fin、CIK、CCK、PF-Fin对Cy HV-2的感染不敏感,特异性巢式PCR检测盲传至第7代Cy HV-2细胞培养物,结果均为阴性;Cy HV-2在Gi CB细胞中的增殖动态研究结果表明:病毒感染细胞经过12 h的隐晦期,24 h开始进入对数生长期,96 h病毒滴度达到最高值(107.52±0.26 TCID50/m L),然后进入平台期;透射电子显微镜观察结果显示,Cy HV-2感染细胞可分为吸附与侵入、复制与装配、成熟与释放3个主要过程,病毒进入对数生长期后,被感染细胞内可见形态典型的疱疹病毒颗粒。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法

根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。

异育银鲫造血器官坏死症病鱼体内鲤疱疹病毒Ⅱ型的电镜观察与超微病理学特征

为分析患鲫造血器官坏死症异育银鲫Carassius auratus gibelio体内不同器官组织中鲤疱疹病毒（CyHV-2）粒子的形态结构、分布和发生过程,采集患病异育银鲫体肾、脾脏、头肾、肝胰脏、肠道、鳃各组织样本,利用透射电镜观察疱疹病毒和组织细胞超微病理学。在所采集器官组织中均观察到鲤疱疹病毒Ⅱ型的DNA内核、空衣壳、实心核衣壳、含包膜成熟病毒共4种不同成熟时期的病毒粒子,不同时期的病毒粒子直径分别为65-90nm、90-180nm、90-180nm、170-220nm;体肾和脾脏中含有大量的Cy HV-2病毒,而头肾、肝胰脏、肠道和鳃中病毒粒子较少;CyHV-2病毒主要感染体肾、头肾、脾脏的吞噬细胞,导致机体免疫机能改变;组织细胞病理学观察发现吞噬细胞核边缘化,核内染色质变性,核膜溶解,线粒体嵴断裂,出现空泡,个别细胞溶解坏死。通过PCR检测和电镜观察病毒粒子结构特征,确诊异育银鲫感染Cy HV-2病毒,主要器官组织细胞中均有CyHV-2病毒,且在细胞核中完成复制和组装,在细胞质中获得外膜。感染Cy HV-2病毒的异育银鲫主要器官组织均受到一定的损伤。

鲤疱疹病毒Ⅱ型对异育银鲫背鳍细胞的显微形态与免疫基因表达水平的影响

为研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)体外感染复制特征以及异育银鲫抗病毒免疫应答反应。本实验采用组织块培养法建立了异育银鲫背鳍细胞的原代培养体系。结果显示,在10 d左右可观察到组织块迁移分离出新的单层细胞,3周左右细胞可覆盖底部面积为25cm2培养瓶的底部;经Cy HV-2悬液感染离体培养的原代细胞,3 d后病毒滴度增殖至106拷贝/m L;在病毒感染6 d后出现典型的细胞病变效应;Cy HV-2感染原代细胞后,分析前期通过鱼体水平实验鉴定出的与该病毒感染相关的免疫基因:PNP5a、MPO、MHCⅠ、LYZ-C、IL-11、ITLN、PNP5a和DUSP,Real-time Rt-PCR结果显示大部分基因在细胞水平均有显著性的上调,与鱼体水平实验结果一致。本研究建立了原代培养的异育银鲫背鳍细胞,用于构建体外感染Cy HV-2病毒的细胞模型,为深入研究Cy HV-2的感染复制规律及其与宿主的相互作用关系,以及细胞水平筛选抗病毒药物实验奠定了基础。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25截短蛋白的多克隆抗体制备与免疫原性分析

鲫(Carassius auratus)造血器官坏死症是我国养殖鲫中新出现的一种传染性病毒性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2),为研制针对该病的有效诊断试剂和疫苗,分析了Cy HV-2 ORF25基因编码蛋白的抗原表位,利用原核表达系统对Cy HV-2 ORF25编码蛋白富含抗原表位的区域进行截短表达,制备了抗Cy HV-2 ORF25编码蛋白的多克隆抗体,通过间接免疫荧光和免疫保护力测定等实验研究了截短表达蛋白的免疫原性。结果显示,原核表达的截短蛋白t ORF25分子质量约为28 k W,蛋白纯化后免疫日本大耳兔制备的多克隆抗体可特异性识别在Gi CB上增殖的Cy HV-2。将截短表达蛋白t ORF25免疫异育银鲫后,感染Cy HV-2,其相对免疫保护率达47%。

鲤疱疹病毒Ⅱ型的核酸恒温扩增微流控快速检测芯片的建立

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)主要感染锦鲤、鲫鱼及其变种,导致造血器官坏死,其致死率高,给养殖业造成了巨大损失。为建立一种快速、灵敏、准确的CyHV-2检测方法,可于大规模暴发之前进行疫情的早期诊断和及时防控,对CyHV-2建立了一种集核酸快速提取方法、竞争性互补介导核酸恒温扩增(competitive annealing mediated isothermal amplification,CAMP)与微流控芯片(microfluidic chip)于一体的检测方法。以CyHV-2基因保守区域片段为靶序列设计特异性引物,通过条件优化建立了一种基于CAMP技术的CyHV-2可视化检测方法,并且对该方法进行了特异性、灵敏性及临床样本的检测进行评估。结果表明:所建立CAMP方法的灵敏度最低检测限为10拷贝;对与其基因型有较高相似性的鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus3,CyHV-3)无非特异性扩增,特异性良好;用本方法对89批次的临床样本进行检测,显示灵敏度及特异性均为100%。核酸快速提取的方法能够较快获得纯度较高的核酸,缩短了核酸提取时间,且极大节约了检测成本,具有操作简单、样本用量少等特点,且经核酸快速提取方法处理的病鱼组织样本能够满足CAMP现场检测的要求。此外,将针对CyHV-2所建立的CAMP可视化检测方法结合微流控芯片,可实现多目标病原的高通量、多指标筛查,将极大提高检测效率。本试验对鲤疱疹病毒Ⅱ型所建立的核酸快速提取、CAMP检测及微流控芯片的方法可在70min内实现对该病毒的现场快速检测及诊断,极大地提高了对CyHV-2疫病的早期防控能力,将为CyHV-2的快速检测及疫情早期预警提供参考。所建立的方法亦可应用于其他经济水生生物病原的现场快速检测及后续防控。

siRNA干扰对鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF57基因表达的影响

研究通过在异育银鲫脊髓细胞系(Spinal cord tissue cell lines of Carassius auratus gibelio,CSC)中对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)ORF57进行RNA干扰,以探究其对CyHV-2病毒复制的影响。首先,以FAM标记的异育银鲫β-actin的siRNA进行CSC细胞转染条件的优化,再将针对CyHV-2 ORF57基因设计的3条siRNA,转染CSC细胞,并进行病毒感染,评估siRNA对病毒复制和致细胞病变的影响。转染条件优化结果显示,在siRNA浓度为80 nmol/L,转染液维持24h后更换维持液,β-actin基因表达量最低且观察到的荧光点数量最多。而ORF57-siRNAs干扰结果显示,ORF57-siRNA-2组表现出了较强的抑制效果,在接毒48h时,ORF57-siRNA-2处理组的ORF57基因表达量降到相对于Mock组的33.55%(P<0.01),并且各ORF57-siRNA组都表现出了延缓CyHV-2致细胞病变的时间和强度,抑制时间可达120h。TCID_(50)结果显示,不同组的ORF57-siRNAs均能降低病毒滴度,其中ORF57-siRNA-2将病毒原液TCID_(50)108.487/mL下降至106.776/mL。研究结果表明,干扰ORF57的表达可大大降低CyHV-2的致细胞病变力和复制率,ORF57在CyHV-2复制与致细胞病变中起重要作用。本研究为CyHV-2基于siRNA技术的抗病毒治疗和弱毒株的改造提供了借鉴。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性分析

为进一步研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)ORF4蛋白的功能,通过PCR扩增CyHV-2 ORF4基因,并构建重组穿梭质粒pFastBac HTA-ORF4,将其转化至大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞后获得重组杆粒Bacmid-ORF4;采用脂质体法转染Sf9细胞后,利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot鉴定重组蛋白,采用His亲和层析柱纯化重组蛋白,并通过小鼠免疫试验分析其免疫原性。结果表明:转染72 h后Sf9细胞逐渐呈现出细胞变圆、细胞核明显增大的形态变化;间接免疫荧光结果显示,重组杆状病毒感染的Sf9细胞中出现了明显的绿色荧光;Western blot结果显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能够与抗His单抗发生特异性反应;小鼠免疫试验显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能诱导小鼠产生特异性免疫反应。研究表明,本研究中获得的CyHV-2 ORF4蛋白有较好的免疫原性,为CyHV-2 ORF4蛋白的功能解析提供了良好材料。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72基因克隆、蛋白原核表达和抗体制备

异育银鲫作为我国重要的淡水经济鱼类,其鳃出血病为主要病害,并造成重大经济损失,该病病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-2).目前,研究主要在该病的检测和病理方面,对于免疫学检测方面研究较少.本研究根据CyHV-2ORF72基因序列设计了1对特异性引物,利用患病异育银鲫肾脏DNA作为模板,通过PCR扩增得到CyHV-2ORF72基因全长,该基因序列全长为1113bp,可编码370个氨基酸的蛋白.该基因与pET-28a表达载体连接构建重组原核表达载体pET-ORF72转入大肠杆菌中,经IPTG诱导表达得到了分子量约为45ku的重组蛋白,与预测的蛋白大小基本一致.将纯化的重组蛋白皮下多点注射免疫新西兰大耳兔制备了ORF72的多克隆抗体,经Western Blotting检测抗体能与病毒粗提液有良好反应,特异性较好,本结果可为下一步建立疫苗和免疫检测方法奠定基础.

异育银鲫中鲤疱疹病毒Ⅱ型载量测定方法的建立

异育银鲫是我国重要的淡水养殖品种,但是鲤疱疹病毒Ⅱ型对其造成了重大经济损失,该病毒致死率几乎可以达到100%。为了能够有效预防和控制该病毒,需要建立一种高效灵敏的定量方法。为此,本实验室根据CyHV-16基因序列设计引物,利用SYBR Green法建立了异育银鲫中鲤疱疹病毒Ⅱ型Realtime PCR方法,可以定量鲫鱼体内疱疹病毒载量,绘制了标准曲线,根据各个组织中病毒的拷贝数分析出该病毒在不同组织中的表达分布,其中脾、肾组织中表达量较高,鳃、肝、肠、肌肉等组织中表达量较低。这些数据为预防和控制异育银鲫Ⅱ型疱疹病毒奠定了实验和研究基础。

鲤疱疹病毒Ⅱ型RAA-LFD检测方法的建立

为了建立一种简便、快捷的现地检测鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)的方法,本文联合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,在优选的RAA下游引物和探针的5’端分别进行生物素(Biotin)和荧光(FAM)标记,通过对RAA反应时间和温度等条件的优化,建立了可用于现地检测CyHV-2的RAA-LFD方法。该检测方法在34℃~40℃恒温下反应10 min即可实现对CyHV-2目的基因片段的有效扩增,与其他常见水生动物疫病病原脱氧核糖核酸(DNA)无交叉反应,RAA扩增产物可直接用LFD肉眼观察,对标准质粒pUC57-CyHV-2的最低检测限为8拷贝/μL,比普通聚合酶链式反应(PCR)灵敏度高出10倍。组内和组间重复性试验表明该方法有良好的重复性和稳定性,使用该方法对45份临床样本进行检测,与普通PCR结果符合率为95%。本文建立的RAA-LFD检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好、操作方便,可用于CyHV-2的临床快速检测。

抗鲤疱疹病毒Ⅱ型卵黄抗体防治异育银鲫鳃出血病案例

近年来由鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)引起的异育银鲫鳃出血病在江苏主产区不断发生,部分池塘鲫鱼死亡率高达80%以上乃至绝收。为防止该病的大流行,盐城市大丰区水产技术推广站与苏州大学联合攻关,研制成功了抗鲤疱疹病毒Ⅱ型卵黄抗体(IgY_(CyHV-2))。经实验室验证,该抗体对感染CyHV-2的异育银鲫免疫保护率在70%以上。

鲤疱疹病毒Ⅱ型检测技术的研究进展

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2),又称为疱疹造血器官坏死病毒(或金鱼造血器官坏死病毒),属疱疹病毒目、疱疹病毒科、鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)。由于是第二个分离自鲤科鱼类的疱疹病毒,该病毒被国际病毒系统分类委员会命名为鲤疱疹病毒Ⅱ型[1-2]。该病毒为双链DNA病毒,无囊膜包被的核衣壳呈六角形或球形,囊膜包被下的病毒粒子成椭圆形,大小为175~200nm[3]。

基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测鲤疱疹病毒2型的方法研究

为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法,并将样品简易处理方法运用于该方法对实验室保存的鲫组织样品进行检测。结果显示,该RPA-LFD检测方法最佳反应条件为40℃20 min,最低检出限为6×10^(0) copies/μL,与荧光PCR的灵敏度相当,与其他鲤疱疹病毒等无交叉反应;运用该方法并结合待检样品简易处理方法(直接RPA法)对50份鲫组织样品进行处理和检测,其结果与运用国家标准(GB/T 36194-2018)中荧光PCR方法检测结果一致。本文建立的RPA-LFD检测方法具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强的优点,适于在水产养殖场和基层部门用于鲤疱疹病毒病的辅助诊断和监测。

鲤疱疹病毒Ⅱ型抗体胶体金检测试纸条的制备和分析

【背景】由鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus-2,CyHV-2)引起的疱疹病毒性造血坏死病在鲫和金鱼中的暴发给水产养殖业造成了巨大的经济损失。【目的】开发一种快速、现场检测鲫是否感染过CyHV-2和监测鲫CyHV-2 IgM抗体水平的胶体金检测试纸条。【方法】将CyHV-2与胶体金结合作为金标抗原、Protein A作为检测线、兔源rORF66多克隆抗体进行划线作为质控线,分析胶体金试纸条最佳制备及组装条件,确定胶体金标记最适pH、金标抗原最适浓度,以及检测线(test line,T线)、质控线(control line,C线)最适划线浓度等。【结果】本研究制备的CyHV-2抗体胶体金试纸条可以使用全血测试,与常见的其他鱼类抗体血清无交叉反应,如草鱼呼肠孤病毒抗体阳性血清、鳜虹彩病毒抗体阳性血清等。试纸条最低限度可以检测到1:100稀释的阳性血清抗体,由试纸条检测线的深浅可以初步判断鱼体中抗体水平。试纸条通过对10条鲫鱼血清样品检测并和金鱼造血器官坏死病毒检测方法(GB/T 36194—2018)进行Kappa分析,Kappa值为0.80,表明二者有较高的符合率。【结论】本研究制备的试纸条具有较高的灵敏度和特异性,具有操作简单和成本较低的特点,对鱼类检疫、鱼体抗体水平评价等具有实际应用价值。