鲨肝刺激物质类似物cDNA片段的克隆及序列分析

目的 :从鲨鱼肝脏中分离纯化肝刺激物质 ,测定N 端氨基酸残基序列 ,根据序列分析结果 ,合成简并引物 ,获得鲨鱼肝刺激物质的cDNA序列 ,并对其进行序列分析 ,比较其与已报道序列的同源性。方法与结果 :通过离子交换和凝胶过滤层析方法 ,从鲨鱼再生肝组织中分离到一种可刺激肝癌细胞株SMMC 772 1增殖活性的多肽 ,命名为鲨鱼肝刺激物质 (sHSS)。进一步通过FPLCMonoQ柱纯化后 ,纯度可达 95 %以上 ,其得率为 4 0mg/kg肝脏 ,SDS PAGE分析表明 :sHSS的分子量约为 1 6 0 0 0Da。对sHSS的氨基酸组分及N 端氨基酸序列进行了分析 ,并根据其N 端氨基酸残基序列设计了一套简并引物 ,利用RT PCR方法从再生肝组织的总RNA中扩增到一大小为 5 0 4bp的cDNA片段 ,序列分析表明其与我们分离到的天然鲨肝刺激物质有一定的差异 ,而与已报道的肝再生增强因子 (ALR)差异较大 ,而与人、鼠以及果蝇中的一种未知功能的蛋白质在氨基酸水平上的同源性较高 ,分别为 84 % ,83%和 5 7% ,这类物质可能在生物机体中发挥重要的生理功能。结论 :通过RT PCR扩增 。

鲨肝刺激物质类似物对CCl_4致小鼠急性肝损伤的保护作用

目的:探讨重组鲨肝刺激物质类似物(r-sHSA)对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用及其作用机制.方法:利用腹腔注射CCl4制备小鼠急性肝损伤动物模型,以血清转氨酶活性以及组织病理变化为指标判断r-sHSA对化学性肝损伤的保护作用,并通过定量RT-PCR方法测定肝组织中相关细胞因子表达量的变化.结果:8～200μg/kg r-sHSA均可显著降低损伤小鼠血清转氨酶的活性,明显减轻肝细胞肿胀,减少中性粒细胞浸润,具有显著的肝保护作用,其机制可能与r-sHSA诱导TNF-a和肝细胞生长因子(HGF)表达,并下调TGF-β1的表达有关.结论:r-sHSA对CCl4致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用,其机制可能与细胞因子的表达调控有关.

鲨肝刺激物质类似物基因在大肠杆菌中的表达与产物活性分析

构建了鲨肝刺激物质类似物基因片段的原核表达载体质粒 (pET-sHSS) ,转化大肠杆菌后通过IPTG诱导获得原核表达产物 ,并利用凝胶层析方法对表达产物进行了分离纯化 ;进一步利用MTT比色法研究了该重组产物对肝癌细胞株SMMC -7721的增殖影响。结果表明 ,在1mmol/L的IPTG的诱导下 ,鲨肝刺激物质类似物基因片段在大肠杆菌BL21菌株中获得表达 ,表达产物的相对分子质量大小约为17500u,占菌体可溶性蛋白总量的38%左右 ;纯化后的产物在低浓度下 (<50ng/L)具有明显刺激SMMC7721细胞株增殖的活性 ,高浓度下 (>100ng/L)则明显抑制该肿瘤细胞株的生长 。

鲨肝刺激物质降血糖作用机制的研究

目的 :研究鲨肝刺激物质的降血糖作用机制。方法 :采用四氧嘧啶糖尿病小鼠模型 ,观察鲨肝刺激物质对糖尿病小鼠空腹血糖、果糖胺、胰岛素、肝糖原、己糖激酶、过氧化脂质等生化指标的影响。采用离体培养原代小鼠肝细胞 ,研究鲨肝刺激物质对四氯化碳、对乙酰氨基酚所致肝细胞损伤的作用。结果 :鲨肝刺激物质显著降低糖尿病小鼠空腹血糖和果糖胺水平 ,增加血清胰岛素、肝糖原含量 ,提高己糖激酶活性 ,减轻四氯化碳、对乙酰氨基酚对原代小鼠肝细胞的损伤。结论 :鲨肝刺激物质降血糖作用机制与保护胰岛和肝细胞功能、提高己糖激酶活性。

鲨肝刺激物质对四氧嘧啶诱发的小鼠糖尿病的保护作用

目的 :研究鲨肝刺激物质对四氧嘧啶诱发的小鼠糖尿病的保护作用。方法 :尾静脉注射四氧嘧啶造小鼠糖尿病模型 ,观察鲨肝刺激物质对糖尿病小鼠糖代谢 (空腹血糖 ,糖化血红蛋白 )、脂代谢 (甘油三酯 ,胆固醇 ,游离脂肪酸 )、抗氧化 (超氧化物歧化酶 ,丙二醛 )及胰岛损伤程度的影响。结果 :鲨肝刺激物质显著降低糖尿病小鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸和丙二醛含量 ,提高超氧化物歧化酶活性 ,减轻四氧嘧啶对胰岛 β细胞的损伤。 结论 :鲨肝刺激物质对四氧嘧啶诱发的小鼠糖尿病具有显著的保护作用。

重组鲨肝刺激物质类似物对刀豆蛋白A致小鼠急性肝损伤的保护作用

为探讨重组鲨肝刺激物质类似物(r-sHSA)对刀豆蛋白A(Con A)致小鼠急性肝损伤的保护作用及其作用机制,利用尾静脉注射Con A制备小鼠急性肝损伤动物模型,以谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性以及组织病理变化为指标判断r-sHSA(30,60,120μg/kg)对免疫性肝损伤的保护作用;同时,检测肝组织丙二醛、谷胱甘肽水平和总抗氧化能力以及血清中TNF-α和IFN-γ的含量,并测定肝组织匀浆中iNOS活力。结果表明,3个给药剂量的r-sHSA均可显著降低肝损伤小鼠血清转氨酶活性,明显减轻肝细胞坏死,减少炎细胞浸润,改善肝脏氧化应激水平,并下调炎症因子表达。结果提示,r-sHSA对Con A致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用,其机制可能与抗氧化和抗炎作用有关。

鲨肝刺激物质类似物在大肠杆菌中的高密度发酵

为建立重组鲨肝刺激物类似物(r-sHSA)的高密度发酵方法,本研究在利用单因素实验和均匀设计实验优化摇瓶发酵培养基的组成和浓度以及诱导剂(IPTG)浓度的基础上,利用5L发酵罐进行了放大试验,探讨了补料方式、补料培养基的组成和浓度、诱导剂加入时间和诱导后菌体的收获时间对工程菌生物量和r-sHSA产量的影响。结果表明:在改良LB培养基(0.97%甘油,0.91%酵母粉,0.72%胰蛋白胨,0.782%KH2PO4,0.267%K2HPO4·3H2O,0.062%MgSO4·7H2O,0.5%NaCl,pH7.0)中,当pH控制在7.0、溶氧浓度为25%～30%的前提下,采用指数补料方式加入优化后的补料培养基(620g/L甘油,94.8g/L胰蛋白胨,3.3mL/L微量元素,7.5g/LMgSO4·7H2O)进行培养,在工程菌的OD600达到23时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导6h后收获菌体,菌体的生物量可达(123.27±1.184)g/L,r-sHSA产量为(2.662±0.041)g/L,比优化前提高了13.7倍。

重组鲨肝刺激物质类似物对CCl_4诱导的急性肝损伤的保护作用

探讨重组鲨肝刺激物质类似物(r-sHSA)对CCl_4急性肝损伤模型的保护作用。采用CCl_4花生油溶液(0.15%,ip)诱导小鼠急性肝损伤,用改良赖氏法测定血清ALT、AST、MDA水平,并观察病理变化。结果显示r-sHSA能显著降低CCl_4所致小鼠ALT和AST升高,恢复AST/ALT比值,降低MDA的含量。病理切片显示r-sHSA能明显减轻CCl_4对肝组织的损伤。r-HSA对CCl_4急性肝损伤小鼠具有一定的保护作用。