斑鳜聚缩虫病并发感染水霉菌的防治试验

为防治斑鳜聚缩虫、水霉菌并发病,采用多种商品渔药及食盐进行了对比试验,筛选出对聚缩虫和水霉菌有一定杀灭效果且对斑鳜毒性较低的植物源性杀虫剂纤虫净和食盐,并进行了联合药物对该病的治疗试验和药物协同作用评判。试验结果显示,在水温18℃~22℃条件下,0.3 mg·L^(-1)的纤虫净与8 000 mg·L^(-1)食盐联合用药连续浸泡144 h对聚缩虫、水霉菌的死亡率均达到100%,植物源性杀虫剂纤虫净与食盐对聚缩虫药效的相互作用为相加,对水霉菌具有协同增强作用,该药物组合对斑鳜聚缩虫病并发感染水霉菌具有较好的疗效。

氨氮胁迫对翘嘴鳜幼鱼抗氧化酶、消化酶活性及应激相关基因表达的影响

为了解氨氮胁迫下翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)幼鱼肝脏、胃抗氧化系统和消化系统的响应机制,以体质量为(15.27±0.67)g的翘嘴鳜幼鱼为研究对象,探讨了6个氨氮胁迫质量浓度(0、10、20、30、40、50 mg/L)下肝脏和胃中谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、脂质过氧化物(LPO)、胃蛋白酶(pepsin)、胃淀粉酶(AMS)、胃脂肪酶(LPS)的活性和IL-1β、IL-8、TNF-α、HSP90α等应激相关基因的表达情况。试验结果表明,随着氨氮质量浓度的提高,肝脏抗氧化相关酶中的SOD、CAT、GSH活性呈先升高后下降的趋势,LPO活性呈逐渐升高的趋势,IL-1β、HSP90α基因表达量呈先升高后降低的趋势,TNF-α表达量呈逐渐升高的趋势,IL-8表达量呈降低-升高-降低的趋势;胃消化酶中的胃蛋白酶活性呈现先升高后降低的趋势,而AMS和LPS活性呈逐渐升高的趋势。结果表明,在低浓度氨氮胁迫条件下,鱼体通过诱导抗氧化酶活性升高和应激相关基因表达上调来应对氧化应激损伤,同时诱导升高胃消化酶活性为机体提供能量,而高浓度氨氮胁迫则抑制了抗氧化酶活性和HSP90α基因的表达。

斑鳜肠道组织对嗜水气单胞菌感染早期的免疫响应

【目的】嗜水气单胞菌是危害斑鳜养殖生产的主要病原之一。研究斑鳜感染嗜水气单胞菌后,其肠道组织基因表达水平的变化,解析鱼体对细菌性感染的免疫应答分子机制,为防控淡水鱼类细菌性疾病提供依据。【方法】用嗜水气单胞菌感染斑鳜6 h后,利用Illumina Hiseq 6000测序平台对斑鳜肠道组织进行RNA-seq测序,并利用生物信息学方法对数据进行分析。【结果】感染组和未感染组斑鳜肠道组织存在1077个差异表达基因(DEGs),包括669个上调DEGs和408个下调DEGs。其中,与免疫相关的上调DEGs主要有基质金属蛋白酶3(MMP3)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-17F(IL-17F)、正五聚蛋白3(PTX3)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)含pyrin结构域蛋白6(NLRP6)、C型凝集素域家族4E(CLEC4E)、胆固醇-25-羟化酶(CH25H)和激活转录因子1(ATF1)等。基因本体(GO)富集分析显示,DEGs主要富集在免疫反应激活信号通路、免疫应答调节细胞表面受体信号通路、T细胞活化的正调控过程以及细胞修复和调节过程上。京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析显示,上调DEGs主要富集在多种疾病发生、发展过程和免疫代谢相关信号通路上。实时荧光定量PCR验证结果表明,7个随机选取的与免疫相关的DEGs的表达量与RNA-seq测序结果存在一致性。【结论】感染组与未感染组斑鳜肠道组织MMP3、IL-1β、PTX3、NLRP6、CLEC4E表达量的差异较为显著,可能是参与斑鳜肠炎发生的关键候选基因。

投喂不同饵料对斑鳜生长及消化性能的影响

【目的】探明斑鳜(Siniperca scherzeri)摄食配合饲料后其生长与消化性能的变化规律,为开展以配合饲料替代传统饵料鱼的斑鳜规模养殖提供参考依据。【方法】选取驯化和未驯化斑鳜苗种各180尾,分别投喂配合饲料和活饵鱼,饲养20周后饥饿24 h,测定分析其生长性能、消化酶活性、肠道组织结构及肠道微生物群落结构。【结果】至饲养20周后,饲料组斑鳜的存活率、脏体比与活饵组斑鳜相比无显著差异(P>0.05,下同),但终末体质量、增重率及饲料系数显著低于活饵组斑鳜(P<0.05,下同);饲料组斑鳜肠道α-淀粉酶活性显著高于活饵组斑鳜,胰蛋白酶活性显著低于活饵组斑鳜,而胃蛋白酶和脂肪酶活性无显著差异。此外,饲料组斑鳜肠道的肌层厚度和黏膜褶皱高度均显著低于活饵组斑鳜,但二者间的肠黏膜褶皱数无显著差异。在肠道微生物群落方面,饲料组斑鳜肠道微生物群落的ACE指数和Chao1指数显著低于活饵组斑鳜,但Shannon指数和Simpson指数无显著差异;2种饵料投喂模式下斑鳜肠道微生物群落结构均以变形菌门、厚壁菌门、软壁菌门和放线菌门为绝对优势菌门,其相对丰度之和在98.00%以上;在属分类水平上,饲料组斑鳜肠道内的伯克霍尔德菌属相对丰度显著高于活饵组斑鳜,而鞘氨醇盒菌属和支原体属相对丰度显著低于活饵组斑鳜。【结论】以配合饲料替代活饵投喂斑鳜,其生长速度显著降低,肠道组织结构、消化酶活性及肠道微生物群落结构出现适应性变化,尤其是配合饲料的投喂有助于维持肠道微生物稳定性。可见,以配合饲料替代活饵养殖斑鳜具有可行性,但还需进一步优化饲料营养组分及投喂策略,提高配合饲料养殖下斑鳜的生长速率。

斑鳜智能化陆基循环水养殖试验

斑鳜俗称黑鳜、岩鳜、圆筒鳜、褐鳜等,为东亚特有名贵经济鱼类,广泛分布于我国内陆水域,也是我国3大养殖鳜类之一。目前尚未见智能化陆基循环水养殖斑鳜的相关报道。2023年项目组开展了斑鳜智能化陆基循环水养殖模式试验示范,并取得了显著成效,现将其技术总结如下。

鄱阳湖禁捕前后鳜(Siniperca chuatsi)生长特性及种群参数研究

【目的】旨在研究禁捕对鄱阳湖鳜(Siniperca chuatsi)生长特性和种群参数的影响,了解鄱阳湖鳜种群恢复情况,为鄱阳湖鳜资源的保护和开发利用,以及评估禁捕效果提供数据支撑。【方法】使用FiSATⅡ软件分析禁捕前(2016—2019年)和禁捕后(2020—2022年)湖区6个采样区域的鳜资源调查数据,评估鄱阳湖鳜资源状态和生长特征。【结果】鳜平均体长和体质量呈逐年增长的趋势,且禁捕后鳜平均体长[(316.20±95.55)mm]和体质量[(1104.80±927.90)g]均显著高于(P<0.05)禁捕前的鳜平均体长[(213.22±63.90)mm]和体质量[(294.07±272.47)g],禁捕后鳜体长大于200 mm或体质量大于250 g的个体数量占比增加,体长变动系数的平均值(SVL=29.14±3.64)显著小于(P<0.05)禁捕前(SVL=35.01±3.46);禁捕后鳜生长参数平均值(K=0.49±0.15、b=3.1651±0.0892)大于禁捕前(K=0.41±0.10;b=3.0715±0.2276),鳜渐进体长[L_(∞)=(581.0±84.9)mm]、渐进体质量[W∞=(6270.77±3088.52)g]和生长性能指数(φ’=5.198±0.233)的平均值均大于禁捕前[L_(∞)=(420.0±61.8)mm;W∞=(2188.44±941.19)g;φ’=(4.846±0.221)];鳜的生长速度和生长加速度在禁捕后呈现逐年增加的趋势;禁捕后鳜平均拐点年龄(2.25龄)相比于禁捕前(2.48龄)降低,但对应平均拐点体长[L_(i)=(278.61±101.30)mm]和拐点体质量[W_(i)=(1269.01±482.86)g]相比于禁捕前[L_(i)=(242.20±70.69)mm;W_(i)=(460.28±403.67)g]有所增加;禁捕后平均捕捞死亡率(u=0.29±0.01)显著小于(P<0.05)禁捕前(u=0.35±0.03),各采样点鳜单位捕捞努力量渔获量(CPUE)也大于禁捕前。【结论】禁捕可以改善鄱阳湖鳜资源小型化的趋势,提高鳜的种群数量,对恢复鳜资源具有一定的积极作用。

左旋肉碱对鳜生长、抗氧化能力及肠道和肝脏功能的改善作用研究

为探讨饲料中添加左旋肉碱对鳜的生长、抗氧化能力及肠道和肝脏组织结构和功能的影响,在鳜基础饲料中分别添加有效含量为0、50、100、150、200和250 mg/kg的左旋肉碱(分别命名为D0、D50、D100、D150、D200和D250),将初始体质量为(53.98±1.32)g的270尾鳜分为6个组,每组3个重复,每个重复15尾,分别饲喂上述饲料进行56 d生长试验。结果显示:1)与D0组相比,D100组增重率显著升高(P<0.05),饲料系数显著降低(P<0.05);D250组增重率显著降低(P<0.05),饲料系数显著升高(P<0.05)。2)与D0组相比,D100组血浆谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著降低(P<0.05),D250组显著升高(P<0.05)。3)与D0组相比,各试验组血浆甘油三酯、总胆固醇含量均显著降低(P<0.05),除D100、D150组血浆低密度脂蛋白胆固醇含量显著降低(P<0.05)外,各组间血浆高密度脂蛋白胆固醇与低密度脂蛋白胆固醇含量差异不显著(P>0.05)。4)与D0组相比,D100组胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和Na^(+)⁃K^(+)⁃ATP酶活性显著升高(P<0.05)。5)随着左旋肉碱添加水平的上升,血浆D-乳酸含量与二胺氧化酶活性先降后升,分别在D150组和D100组达到最低值,较D0组显著降低(P<0.05);各试验组血浆内毒素含量均较D0组显著降低(P<0.05)。6)与D0组相比,D100组血浆与肝脏总抗氧化能力显著升高(P<0.05),肝脏丙二醛含量显著降低(P<0.05);此外,各试验组血浆免疫球蛋白M含量均显著升高(P<0.05)。7)D100组肠道绒毛长度、杯状细胞密度较D0组显著升高(P<0.05),D250组较D0组变化不显著(P>0.05);D100组和D250组肌纤维直径显著降低(P<0.05),肌纤维密度显著升高(P<0.05),肝脏油红切片脂滴占比较D0组显著减少(P<0.05)。综上所述,左旋肉碱可促进鳜肠道发育,增强消化吸收能力,提高生长速度,同时具有提高免疫力、减少肝脏脂肪沉积、改善肌肉品质的作用。以增重率与饲料系数为效应指标进行拟合可得,鳜饲料中左旋肉碱的适宜添加水平为79.27~80.61 mg/kg。

脑室注射葡萄糖对翘嘴鳜摄食和糖代谢的影响

为探究鳜下丘脑葡萄糖感知系统的存在和对摄食的影响,实验以翘嘴鳜为研究对象,对鳜分别进行脑室注射生理盐水(对照组)、2-DG(葡萄糖代谢拮抗剂,100 mg/kg)和葡萄糖(10 mg/kg),探究注射后3、6和12 h不同时间点鳜摄食及糖代谢的响应机制。结果显示,脑室注射葡萄糖显著抑制鳜的摄食,而不同时间点鳜血浆葡萄糖含量无显著差异。脑室注射葡萄糖显著诱导下丘脑葡萄糖激酶基因gk(glucokinase,6 h),表明鳜下丘脑葡萄糖感知体系的存在。且脑室注射葡萄糖显著促进可卡因和苯丙胺调节转录肽基因cart(cocaine and amphetamine regulated transcript,3 h)的表达量,这可能与鳜mTOR(mammalian target of rapamycin)在下丘脑(12 h)和肝脏(6 h)中的基因表达水平的显著上调有关。另外,脑室注射葡萄糖显著诱导鳜肝脏gk(6 h)和pk(pyruvate kinase,3 h)的表达,促进糖酵解,表明脑室通过感知的葡萄糖水平促进分解代谢为机体供能。综上,本研究首次通过脑室注射葡萄糖探究鳜下丘脑葡萄糖感知系统的存在,同时发现鳜下丘脑对葡萄糖脑室注射存在响应。且脑室注射葡萄糖可能通过对gk的调控影响AMPK/mTOR通路,调控机体食欲相关基因表达进而抑制摄食。研究结果为翘嘴鳜对饲料碳水化合物的高效利用和摄食调控研究提供理论依据。

鳜弹状病毒N蛋白与鳜c-Myc互作调控谷氨酰胺代谢机制

为了研究鳜弹状病毒(SCRV)如何调控鳜c-Myc(Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制,本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白,初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白);Co-IP结果显示,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc存在相互作用。通过PCR扩增获得了带有Flag标签序列的SCRV-N基因的ORF片段,并构建了SCRV-N蛋白过表达载体pcDNA-N-Flag;将pcDNA-N-Flag质粒转染鳜脑组织细胞系(CPB细胞系),荧光共定位结果显示,Sc-c-Myc与SCRV-N在细胞质内存在共定位现象;通过逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)和免疫印记(Western blot)检测转染pcDNA-N-Flag的CPB细胞系中Sc-c-Myc及谷氨酰胺代谢通路关键酶(GLS1、GDH和IDH2)的表达变化,发现Sc-c-Myc、GLS1的转录水平和蛋白水平均显著上调。综上表明,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc互作促进Sc-c-Myc的表达,进而调控宿主细胞谷氨酰胺代谢途径,为SCRV防控提供了新的靶点。

活饵与饲料投喂对幼鳜肠肽酶活力及小肽转运、吸收的影响

以初始体重(6.77±0.64)g的鳜(Siniperca chuatsi)为实验对象,从消化道肠肽酶活力和小肽转运吸收方面比较研究鳜对活饵与饲料消化吸收能力的差异。实验采用3种分组投食策略,将鳜分活饵组(仅投喂活饵鱼)、饲料组(仅投喂饲料)、复投活饵组(以下简称复投组,先投喂饲料后活饵鱼)。活饵组、饲料组分别饲养22d,复投组经5d驯饲、15d饲料和2d活饵喂养。饲养结束时在各组进食0.5h、1h、2h、3h、6h、12h、16h时分别取样肠和幽门盲囊,测定氨肽酶和羧肽酶含量与活力,小肽转运载体基因Pept1a、Pept1b和Pept2 mRNA表达水平,及进食12h后肠内容物及粪便中残余小肽含量。结果表明:各组羧肽酶、氨肽酶含量变化无显著性规律,酶活力总体呈先升后降趋势;活饵组肽酶活力峰值显著高于复投组高于饲料组(P<0.01),复投组由饲料转喂活饵后,肠道肠肽酶活力显著上升;各组前肠、中肠及幽门盲囊Pept1a、Pept1b mRNA表达显著高于后肠(P<0.01),后肠则以Pept2 mRNA高表达(P<0.01)。在复投组摄食活饵后,小肽转运载体基因表达水平较饲料组迅速回升(P<0.01);摄食12h,复投组肠内容物小肽含量显著高于活饵组和饲料组,小肽吸收效率随消化时间延长而上升。饲料组粪便中小肽含量显著高于活饵组与复投组,未转运的小肽中含必需氨基酸居高。综上所述,投喂鳜配合饲料,对肠肽酶活力、小肽转运载体基因表达和小肽吸收速率均产生不利影响,鳜对饲料蛋白的分解和小肽转运吸收效率显著低于活饵鱼。

谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜生长、脱氨及糖代谢的影响

为探究谷氨酸(Glu)和α-酮戊二酸(AKG)对鳜(Siniperca chuatsi)摄食和氨排泄的影响,实验以鳜[初始体重(26.28±0.99)g]为研究材料,将Glu和AKG分别添加到鳜的基础日粮中(添加量2%),进行了60d的养殖实验,前40d等量投喂,后20d饱食投喂。通过设置对照组、Glu组和AKG组,比较了3种不同饲料饲喂下鳜的摄食与氨排泄差异情况。实验结果表明,在等量饲喂期间添加Glu、AKG显著提高鳜生长和降低饵料系数,且在一定程度上降低鳜的体外氨排泄量。在饱食投喂阶段,Glu、AKG组的血液中的葡萄糖含量增加,肝糖原、肌糖原含量降低。两个投喂阶段结果都表明,饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸能显著促进鳜脑中npy表达并抑制pomc表达,显著提高蛋白质效率比和特定生长率,增加鱼体体重,促进鱼体生长且降低饲料系数。同时,肝脏中gdh表达及肌肉ampd表达均提高,脱氨代谢供能水平升高,最终导致其氨排泄量升高。此外,饲料中添加Glu和AKG可促进肝脏pepck、g6pase、pk和gk基因表达量增加,糖代谢增强,减少蛋白质的分解供能。综上所述,在饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸均能促进鳜的摄食并降低氨的排泄。研究结果将应用于鳜的低氨排放养殖,并推进谷氨酸和α-酮戊二酸在鳜饲料中的应用。

鳜Shh基因分子特征和时空表达规律及其对肌肉生长的调控

研究从鳜(Siniperca chuatsi)基因组中获得Shh(Sonic hedgehog)基因序列,对该基因编码的蛋白质和同源进化特征进行了分析。鳜Shh基因的开放阅读框(ORF)为1242 bp,编码413个氨基酸,分子量为46.01 kD,等电点(pI)为6.57,脂溶系数为82.83,亲水性平均系数为−0.292,拥有一个跨膜区,被推定为亲水性膜结合蛋白。Shh蛋白具有两个结构域,即Hh-N和Hh-C结构域。鳜Shh蛋白与自身所属的鲈形目鱼类Shh蛋白同源性较高。通过实时荧光定量PCR技术检测了鳜Shh基因的时空表达水平。结果显示:Shh的表达量在神经胚期表达显著上调,并在胚胎发育中后阶段保持较高水平。Shh在鳜不同组织中存在一定的表达差异,在脑、肠道中表达量较高,而在红肌、白肌等组织中表达量相对较低。通过环巴胺(Cyclopamine)处理鳜胚胎来抑制Shh信号通路的实验表明,Shh信号通路被抑制后,Pax3、Pax7、Myomaker、生肌调节因子及肌球蛋白重、轻链等基因的表达均显著降低,推测Shh参与调控鳜肌细胞的早期分化和发育过程。研究将有助于从分子水平了解Shh信号调控鱼类发育的分子机理,为鱼类发育生物学以及健康养殖提供参考依据。

Plectranthias kamii Randll,1980(Perciformes:Serranidae)collected from Bitung, North Sulawesi: first record from the Southwest Pacific Ocean

Three specimens of the serranid fish(Serranidae), Plectranthias kamii Randall, 1980 were collected from fish market, Bitung, North Sulawesi on May and June 2010. Some morphological characters P. kamii is closely related to P. sheni, P. megalophthalmus, P. retrofasciatus, P. rubrifasciatus, P. knappi, P. helenae, P. pelicieri, P. jothyi, P.retrofasciatus and P. randalli in sharing of body width, upper jaw length, pelvic spine length and orbit diameter.Meristic count characters of P. kamii differ from P. sheni, P. pilicieri, P. megalophthalmus, P. retrofasciatus and P.rubrifasciatus in having more numerous dorsal spine(18 vs. 15–17) and below lateral line(33–34 vs. 29–33) and differ from P. megalophthalmus and P. rubrifasciatus in having more numerous pored scales in lateral line(13 vs.14–15) and shorter of anal spine. The present anthiine fish collected from Bitung, Indonesia was described as new record and bringing the total number of species of this genus known in Indonesia to seven.

饲料中谷氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸钠对鳜摄食、生长、胃肠及肝功能的影响

为研究谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸钠(MSG)对鳜(Siniperca chuatsi)摄食、生长及胃肠功能的影响,以鳜基础饲料为对照组(CON),分别添加0.2%和0.4%的Glu、Gln和MSG,命名为Glu-0.2、Glu-0.4、Gln-0.2、Gln-0.4、MSG-0.2和MSG-0.4六个处理组,饲喂初始体质量为(17.60±0.53)g的鳜56d。同CON相比,结果显示:(1)三种添加剂均显著提高摄食量,其中MSG组最明显;(2)Glu-0.2和Gln-0.2的增重率、饲料转化率显著提高;(3)各添加组的胃蛋白酶活力和Glu-0.2、Glu-0.4、Gln-0.2的胃H+-K+-ATPase活力显著增强;(4)肠道中的胰蛋白酶活力在Glu-0.2显著提高,Na+-K+-ATPase活力在Gln-0.4无促进作用,其他组均显著增强;(5)Glu组、MSG组血浆中D-乳酸、内毒素含量和二胺氧化酶活性均显著降低;(6)Gln组血浆AST和ALT显著升高,且肝细胞肿胀、空泡化明显增多;(7)Glu组和MSG组血浆抗氧化能力显著升高,Gln组显著降低;(8)肠道微生物组成Glu-0.2的门水平软壁菌门(Tenericutes)、属水平索氏鲸杆菌属(Cetobacterium)丰度显著高于CON组。综上,Glu具有促进鳜胃酸分泌和胃肠消化吸收能力,增强肠道物理屏障,改善肠道菌群,促进生长;Gln能提升鳜胃肠功能,而机体抗氧化力、肝功能下降;MSG促进摄食和生长效果最佳,但对饲料转化无改善。

鄱阳湖流域野生和养殖翘嘴鳜肌肉营养成分评价

试验旨在研究鄱阳湖流域野生和养殖翘嘴鳜(SiniPercachuatsi)肌肉营养成分。选择鄱阳湖流域野生和养殖翘嘴鳜各30尾,检测肌肉常规成分、氨基酸、脂肪酸、矿物质含量。结果显示,野生样本肌肉中水分含量显著高于养殖样本(P<0.05),粗蛋白和粗脂肪含量显著低于养殖样本(P<0.05)。野生和养殖翘嘴鳜肌肉中氨基酸种类相同,野生样本肌肉中组氨酸含量(0.34%)显著低于养殖样本(0.36%)(P<0.05)。鄱阳湖流域野生和养殖翘嘴鳜鱼氨基酸组成均符合FAO/WHO标准。野生样本肌肉中C20∶5n3(EPA)含量(1.33%)显著高于养殖样本(0.34%)(P<0.05),C22∶6n3(DHA)含量(2.66%)显著高于养殖样本(1.10%)(P<0.05)。野生样本硒含量(0.45 mg/kg)显著高于养殖样本(0.23 mg/kg)(P<0.05)。研究表明,鄱阳湖流域野生和养殖翘嘴鳜的肌肉氨基酸组成较为接近,营养价值较高,翘嘴鳜在养殖环境下各项营养指标基本媲美野生样本。

在不同养殖背景下鳜mc1r组织表达差异和启动子转录调控分析

为探究鳜(Siniperca chuatsi)黑素皮质素1受体基因mc1r在不同养殖背景下的组织表达差异及转录调控机制,研究以在黑白养殖背景下产生的深、浅色体表鳜为研究对象,通过实时荧光定量PCR测定mc1r基因的组织表达差异;其次以鳜基因组DNA为模板,通过PCR扩增mc1r基因5′侧翼区不同长度的缺失片段并克隆至pGL3-Basic载体,之后将重组质粒转染到HEK 293T细胞,检测双荧光素酶的相对活性并预测其存在潜在的转录因子。结果显示,黑色背景养殖所产生的深色体表鳜与野生型更为相似;RT-qPCR检测显示深色体表鳜mc1r在背部皮肤和腹部皮肤表达量最高,而浅色体表鳜脑中表达量最高;双荧光素酶活性检测发现,构建的5个缺失片段启动子活性之间存在显著差异,且−159∽−+292启动子活性最高,推测其为mc1r核心启动子区域,并且通过在线软件预测出存在MITF、SP1等转录因子。研究克隆了鳜mc1r基因启动子区域并进行了转录活性分析,并且对潜在的转录因子进行了预测,为鱼类mc1r基因分子机制表达调控及表皮颜色可控性研究提供了理论依据。

温度对鳜体表黏液细胞及黏液免疫因子的影响

鱼类体表黏液细胞分泌大量黏液,构成机体防御的第一道防线。为探明不同温度条件(10、20、30℃)对鳜体表黏液细胞类型和黏液免疫因子的影响,以体质量(19.0±3.2)g、体长(11.0±1.5)cm鳜为试验对象,利用阿辛蓝-过碘酸雪夫染色法观察试验开始72 h时3种温度对体表黏液细胞分布与类型变化的影响。结果显示:鳜体表黏液细胞含有4个类型,头部单位面积皮肤所含有的黏液细胞数量最多,躯干部黏液细胞数量次之,尾部数量最少;相较于10℃组,20℃组和30℃组体表Ⅱ型黏液细胞增幅最大,Ⅳ型次之,Ⅰ型呈略减趋势,Ⅲ型变化无规律。于试验开始后第0、36、72 h采集皮肤组织和体表黏液,分别通过实时荧光定量PCR和双抗体夹心酶联免疫法检测皮肤免疫因子IgM、IL-1β、Hepcidin基因表达量变化和体表黏液中酸性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶活性变化,结果显示:IgM、Hepcidin基因表达量均随温度升高而上调,相较于10℃组,20℃组IL-1β基因表达量显著上调,而30℃组表达量下调;30℃组中,酸性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶活性显著高于10℃组和20℃组。试验结果表明,环境温度显著影响鳜皮肤黏液细胞类型、数量及免疫相关因子的表达和活性。

翘嘴鳜肝脏组织原代细胞培养技术的建立

运用组织块贴壁法、酶消化法、组织块联合酶消化法探究体质量(33.2±0.2)g翘嘴鳜肝脏组织原代细胞最适培养方法,采用3种培养基(M199培养基、L15培养基、M199-L15)、3种培养容器(12孔板、6孔板、T25培养瓶)及有无CO_(2)探究翘嘴鳜肝脏组织原代细胞最适培养条件,采用线粒体16S rRNA基因序列和染色体数目鉴定细胞,研究氯化铵(0、1、5、10mmol/L)对细胞形态和增殖的影响。试验结果显示:0.25%胰蛋白酶-EDTA消化翘嘴鳜肝脏组织获得细胞,接种到T25培养瓶,生长培养基为M199-L15(体积比1∶1)混合培养基并添加20%体积胎牛血清,在28℃含5%CO_(2)的培养箱中培养,第2~3天贴壁细胞占瓶底的25%~30%,第4~5天细胞长满瓶底的70%~80%,第6~7天得到可传代的原代细胞;传代后细胞饱满、增殖能力强,为上皮样和成纤维样的混合,以成纤维样细胞为主,已传到10代;细胞线粒体16SrRNA基因测序结果与GenBank中基因序列(HQ731435.1)的一致率达99.05%,染色体数目为48条,证明此细胞来自翘嘴鳜;5mmol/L和10mmol/L氯化铵暴露对细胞形态和活力有显著影响(P<0.05)。本试验建立了翘嘴鳜肝脏组织原代细胞培养技术,为开展翘嘴鳜生物学、疾病学、营养学及遗传学等提供重要基础,同时为鱼类肝脏组织细胞原代培养和建系提供重要参考。

不同营养水平对鳜幼鱼糖异生和糖原分解的影响

为探究正常投喂、葡萄糖注射和饥饿3种不同营养水平对鳜内源葡萄糖生成途径的影响,测定正常投喂、葡萄糖注射和饥饿3个试验组鳜的血糖含量、肝糖原含量、胰岛素水平、胰高血糖素水平及糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、果糖-1,6-二磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶和糖原磷酸化酶活性,以及各酶基因mRNA相对表达水平。结果显示,正常投喂组血糖、肝糖原含量均出现显著升高;胰岛素水平显著升高,胰高血糖素水平显著降低。糖异生关键酶活性无显著变化,糖原磷酸化酶活性受到抑制;果糖-1,6-二磷酸酶、糖原磷酸化酶基因表达水平受到抑制。葡萄糖注射组血糖、肝糖原含量显著升高;胰岛素水平显著升高、胰高血糖素水平显著降低;磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性受到抑制,果糖-1,6-二磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶活性不受抑制,糖原磷酸化酶活性受到抑制;磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、果糖-1,6-二磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶基因表达水平无显著变化,糖原磷酸化酶基因表达水平受到抑制。饥饿5、10d,血糖水平糖原磷酸化酶活性显著升高,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、果糖-1,6-二磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶活性无显著变化;糖原磷酸化酶基因表达水平显著升高,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、葡萄糖-6-磷酸酶基因表达水平显著升高;饥饿15d,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、果糖-1,6-二磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶活性显著升高,糖原磷酸化酶活性下降至饥饿前水平;磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、果糖-1,6-二磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶基因表达水平显著升高,糖原磷酸化酶基因表达水平显著下降。结果表明,正常摄食的鳜血糖水平显著升高,糖异生途径无显著变化,糖原分解途径显著抑制。0~6h血糖升高,推测为食物消化吸收所致,6h到达“高血糖”峰值。6~16h食物消化吸收继续,葡萄糖吸收后,糖原合成明显提高,从而维持血糖平衡。由于血糖水平高,同时,糖原分解途径抑制(糖原磷酸化酶活性0~12h下降)。6h血糖最高,反映了鳜鱼维持“血糖平衡”的时间,如果血糖继续升高,可能会引起机体生理异常。故血糖水平对鳜糖异生和糖原分解途径影响不同,糖异生与糖原分解途径受血糖水平调节。

溶解氧昼夜变化对鳜血液生理生化指标及血红蛋白基因表达的影响

【目的】探究养殖水体溶解氧昼夜变化下鳜(Siniperca chuatsi)血液生理生化指标及血红蛋白基因(Hb)应答的变化规律,为揭示鱼类的短期低氧适应机制提供理论依据。【方法】以健康的鳜幼鱼为研究对象,通过转录组测序和基因组测序数据匹配,鉴定出鳜Hb基因序列,并进行生物信息学分析。在7:00、11:00、17:00和23:00等4个时间点采集鳜血液样品,使用PROCANPE-6800血细胞分析仪测定红细胞数、血红蛋白含量、红细胞压积、平均红细胞血红蛋白浓度和平均红细胞体积,采用实时荧光定量PCR检测Hb基因的表达变化。【结果】共鉴定获得11个鳜Hb基因,包括6个α型Hb基因(hbae4、hbae、hbae1.1、hbae5、hbaa1和hbaa1.1)及5个β型Hb基因(hbbe2、hbba2.1、hbba1、hbba1.1和hbba2);除hbae4基因序列由6个外显子和5个内含子构成外,其余10个基因序列均由3个外显子和2个内含子构成。11个鳜血红蛋白均不存在跨膜结构和信号肽,亚细胞定位于细胞质,其二级结构由α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲构成。池塘水体溶解氧含量存在周期性的昼夜变化;溶解氧含量最低时(7:00),鳜血液红细胞数、红细胞压积、血红蛋白含量和平均红细胞血红蛋白浓度均最高,显著高于其他3个时间点(P<0.05,下同);溶解氧含量最高时(17:00),红细胞数、红细胞压积和血红蛋白含量则显著低于其他3个时间点;平均红细胞体积在4个时间点无显著变化(P>0.05)。hbae4、hbae、hbae1.1、hbae5、hbaa1.1、hbbe2、hbba2.1、hbba1和hbba2基因的相对表达量均随溶解氧昼夜变化呈先上升后下降趋势,于17:00时达最高值,且这9个Hb基因在4个时间点的表达模式基本一致,即低溶解氧时相对表达量最低,高溶解氧时相对表达量最高;而hbaa1和hbba1.1基因相对表达量与溶解氧含量成反比。【结论】鳜通过调节红细胞数、血红蛋白含量和平均红细胞血红蛋白浓度等机制及调控Hb基因表达,以适应溶解氧的昼夜变化,从而保持机体供氧稳定。