鳜蛙病毒及鳜弹状病毒双重PCR检测方法的建立及应用

为建立可以同时检测鳜蛙病毒(SCRIV)和鳜弹状病毒(SCRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的SCRIV MCP基因和SCRV N基因序列保守片段分别设计特异性引物,将扩增的MCP基因和N基因分别克隆于pEASY-T1载体,构建重组质粒标准品p-SCRIV和p-SCRV,通过优化退火温度和引物浓度建立了可以同时检测SCRIV(400 bp)和SCRV(280 bp)的双重PCR方法。利用该方法对传染性胰坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、锦鲤疱疹病毒、新加坡石斑鱼虹彩病毒、神经坏死病毒、传染性脾肾坏死病毒、罗非鱼湖病毒及鲤春病毒血症病毒等鱼类常见病毒均无扩增条带,而仅对SCRIV和SCRV有特异性扩增条带,特异性较强;该方法对p-SCRIV的检测下限是1 000拷贝/μL,对p-SCRV检测下限是430拷贝/μL,敏感性较高。对21份临床样品的检测结果表明该双重PCR方法的扩增结果与单一PCR扩增结果一致,二者的符合率为100%。本研究建立的双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较高,可以用于上述两种病毒的快速鉴别检测和分子流行病学调查。

刺五加水提物抗鳜蛙虹彩病毒活性及其对大口黑鲈免疫调节作用的研究

【目的】研究刺五加水提物(Acanthopanax senticosus aqueous extract,ASAE)对鳜蛙虹彩病毒(Mandarin ranavirus,MRV)的抑制作用及其对大口黑鲈免疫调节功能的影响。【方法】用不同剂量ASAE(1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL)与MRV同时作用鳜鱼脑细胞系(SCB3),检测ASAE对MRV的抑制活性。在基础饲粮中添加5‰ASAE,连续饲喂大口黑鲈15 d,实时荧光定量PCR和流式细胞术分析ASAE对大口黑鲈免疫功能的影响,并以1×10^(7)TCID 50/mL MRV腹腔注射攻毒,分析ASAE抗MRV保护效果。【结果】1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL ASAE对MRV抑制率分别为95.27%、91.36%、84.55%、60.05%、32.16%和2.49%。实时荧光定量PCR结果显示,ASAE诱导大口黑鲈白介素-10(interleukin-10,IL-10)、酪氨酸激酶(tyrosine-protein kinase,Lyn)、肌动蛋白相关蛋白(actin related protein 2/3 complex,subunit 5,ARPC5)、Fcγ受体Ⅰa(FcγreceptorⅠa,FcγRⅠa)等Fcγ受体吞噬通路相关基因显著性上调表达(P<0.05);流式细胞术分析结果显示,添加ASAE明显提高了大口黑鲈头肾白细胞吞噬能力(吞噬率80.9%)。攻毒试验结果显示,ASAE对MRV的相对保护率为30.48%。与对照组相比,ASAE明显延缓了大口黑鲈死亡时间,且添加ASAE组脑、脾脏、中肠、后肠组织的病毒拷贝数显著降低(P<0.05)。【结论】ASAE可显著激活大口黑鲈吞噬活性,发挥免疫调节作用,体内外试验均表明ASAE具有优异的抗MRV效果,可以有效预防MRV感染。