靶向抑制GOT1介导的铁死亡途径逆转食管鳞癌细胞顺铂耐药的机制

目的:探究靶向抑制谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(GOT1)是否通过介导铁死亡途径影响食管鳞癌细胞顺铂(DDP)耐药性,并探究分子机制。方法:CCK-8法和细胞集落形成实验检测DDP敏感细胞株Eca-109与DDP耐药细胞株Eca-109/DDP的存活率、集落形成数目,RT-qPCR和Western blot检测Eca-109细胞和Eca-109/DDP细胞中GOT1表达水平差异;将Eca-109/DDP细胞分为对照组、siNC组、siGOT1组、siGOT1+铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)组,CCK-8法检测不同浓度DDP处理下各组细胞存活率,细胞集落形成实验检测各组细胞集落形成数目,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,DCFH-DA染色法检测各组细胞内活性氧(ROS)水平,比色法检测各组细胞中铁离子(Fe2+)浓度,Western blot检测各组细胞中铁死亡效应因子酰基辅酶A合成酶长链家族成员4 (ACSL4)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)的蛋白表达水平。结果:与Eca-109细胞比较,不同浓度DDP处理下Eca-109/DDP细胞存活率增高(P<0.05),细胞集落形成数目增加(P<0.05),细胞中GOT1 mRNA与蛋白相对表达量上调(P<0.05)。与对照组比较,siGOT1组Eca-109/DDP细胞在不同浓度DDP处理下的存活率降低(P<0.05),细胞集落形成数目减少(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),细胞中ROS水平和Fe2+浓度升高(P<0.05),ACSL4蛋白相对表达量上调(P<0.05),GPX4和SLC7A11蛋白相对表达量下调(P<0.05);与siGOT1组比较,siGOT1+Fer-1组Eca-109/DDP细胞在不同浓度DDP处理下的存活率升高(P<0.05),细胞集落形成数目增加(P<0.05),细胞凋亡率减少(P<0.05),同时,细胞中ROS水平和Fe2+浓度降低(P<0.05),ACSL4蛋白相对表达量下调而GPX4和SLC7A11蛋白相对表达量上调(P<0.05)。结论:靶向抑制GOT1能够提高食管鳞癌耐药细胞Eca-109/DDP对DDP的敏感性,促进该耐药细胞凋亡,这一作用与促进铁死亡途径有关。

清毒栓提取物对人子宫颈鳞癌细胞免疫逃逸的影响

目的 研究清毒栓提取物对人子宫颈鳞癌细胞(SiHa细胞)免疫逃逸的影响,探讨清毒栓提取物治疗宫颈人乳头瘤病毒感染的免疫机制。方法 选择均匀成团生长的jurkat细胞,使用SiHa上清液培养jurkat细胞48小时,采用染色质免疫沉淀技术检测SiHa细胞上清液处理后jurkat细胞中叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Forkhead boxP3,Foxp3)含量。取Foxp3高表达的T细胞模型,用血清药理学方法制备的清毒栓含药血清和对照血清进行干预,采用染色质免疫沉淀技术、实时荧光定量PCR法、流式细胞术分别检测jurkat细胞中Foxp3蛋白表达水平、Foxp3转录水平,以及Foxp3阳性细胞比例。结果 SiHa上清液可以显著增加jurkat细胞中Foxp3含量(P<0.05),且处理48小时效果最为显著;jurkat细胞经清毒栓含药血清处理后,细胞中的Foxp3蛋白表达显著下调(P<0.05);在含药血清浓度为15%和20%时,Foxp3的蛋白表达量最低,但两者无明显差别(P>0.05);清毒栓含药血清可以显著降低jurkat细胞模型中Foxp3转录和蛋白水平以及Foxp3阳性细胞数(P<0.05)。结论 清毒栓含药血清通过抑制jurkat T细胞中的Foxp3转录和蛋白表达,降低Foxp3阳性细胞数及Treg细胞比例,从而抑制宫颈SiHa细胞的免疫逃逸,增加机体对宫颈SiHa细胞的免疫反应性。

PD-L1/PD-L2对食管鳞癌细胞恶性表型的影响及耐药研究

目的探讨程序性死亡配体1/2(PD-L1/PD-L2)对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及对化疗药物的敏感性。方法在体外食管鳞癌KYSE150细胞系水平上,分别构建PD-L1杂合子敲除细胞系,慢病毒转染PD-L2过表达,将细胞分为WT组(PD-L1野生型)和PD-L1^(+/-)组(PD-L1杂合子敲除)、Ctrl组(对照)和OE-PD-L2组(PD-L2过表达),用RT-qPCR和Western blot验证PD-L1杂合子敲除和慢病毒转染PD-L2过表达效果以用于后续实验。采用EdU、细胞克隆形成实验、Transwell实验检测各组细胞增殖、迁移和侵袭能力。通过CCK8法检测细胞增殖能力并计算抑制率来评估细胞对化疗药物的敏感性。结果与野生型WT组相比,PD-L1^(+/-)组细胞增殖(P<0.001)、迁移(P<0.01)和侵袭能力(P<0.05)明显降低,差异有统计学意义。与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖和迁移能力增加(P<0.05),而侵袭能力无明显差异(P>0.05)。在顺铂药物梯度浓度干预下,与WT组相比较,PD-L1^(+/-)组细胞增殖活力明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。当顺铂药物浓度为20μmol/L时,与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力无明显变化(P>0.05),而在40μmol/L药物浓度作用下,与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力显著上升,差异有统计学意义(P<0.001)。加入不同浓度的五氟尿嘧啶后发现,与WT组相比,PD-L1^(+/-)组细胞增殖活力显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力显著下降(P<0.01)。比较WT组与PD-L1^(+/-)组特异性表达差异的蛋白,共获得25个差异表达蛋白质,其中差异倍数最为显著的上调蛋白为EGFR(Ser1070),下调蛋白为Smad4。结论PD-L1能够促进食管鳞癌细胞的恶性表型;PD-L2可以促进食管鳞癌细胞(ESCC)的增殖和迁移;PD-L1/PD-L2可以影响肿瘤细胞对顺铂和五氟尿嘧啶化疗药物的敏感性。

淫羊藿苷对口腔鳞癌细胞系CAL27铁死亡的作用

目的探讨淫羊藿苷(icariin,ICA)对人口腔鳞癌细胞系CAL27细胞铁死亡的影响及其可能的作用机制。方法用不同浓度ICA处理人口腔鳞癌细胞系CAL27,用CCK-8法检测细胞增殖情况以选取最佳浓度;用不同浓度铁死亡抑制剂处理CAL27细胞,用CCK-8法检测铁死亡抑制剂对细胞的毒性作用以选取最佳浓度;将CAL27细胞随机分为对照组、ICA组和ICA联合铁死亡抑制剂组。用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力;检测各组细胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测细胞铁死亡影响因子重链亚基溶质载体家族7成员11(solute vector family 7 member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH1)mRNA的表达情况;用蛋白印迹法(Western blotting)检测c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino terminal kinase,JNK)和p53蛋白(protein 53,p53)的表达情况。结果CAL27细胞增殖能力随着ICA和铁死亡抑制剂浓度的升高而降低(P<0.05);与对照组比较,ICA组CAL27细胞侵袭数量、细胞迁移数量、SOD、GSH、SLC7A11和GPX4 mRNA的表达水平降低,MDA和FTH1 mRNA、JNK和p53蛋白的表达水平升高(P<0.05);与ICA组比较,ICA联合铁死亡抑制剂组CAL27细胞侵袭数量、细胞迁移数量、SOD、GSH、SLC7A11和GPX4 mRNA的表达水平升高,MDA、FTH1 mRNA表达水平、JNK和p53蛋白的表达水平降低(P<0.05)。结论ICA对口腔鳞癌细胞CAL27增殖、侵袭和迁移能力有一定的抑制作用,可能是通过激活JNK/p53通路提高细胞内铁死亡相关因子水平,降低细胞抗氧化能力发挥作用的。

二甲双胍抑制人宫颈鳞癌细胞系SiHa和CaSKi增殖及促进细胞凋亡

目的研究二甲双胍(Met)对宫颈鳞癌细胞增殖的影响及作用机制。方法CCK-8法检测人宫颈癌鳞癌细胞系SiHa和CaSKi的增殖,计算二甲双胍半抑制浓度(IC_(50))。流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。Western blot检测腺苷酸活化蛋白激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK-mTOR)信号通路相关蛋白表达。结果随着药物浓度增加、作用时间延长,细胞增殖率下降(P<0.05)。SiHa细胞48和72 h IC_(50)浓度分别为(50.95±2.63)和(21.39±5.23)mmol/L,CaSKi细胞48和72 h IC_(50)浓度分别为(9.98±1.63)和(7.47±2.09)mmol/L。Met组G_(2)/M期细胞含量减少,S期细胞含量增加(P<0.05)。Met组细胞凋亡率较对照组增加(P<0.05)。Met组磷酸化-AMPK(p-AMPK)表达量增加,磷酸化-S6K(p-S6K)、磷酸化-4E-BP1(p-4E-BP1)表达量减少(P<0.05)。结论二甲双胍抑制宫颈鳞癌细胞系增殖的作用可能与促进细胞凋亡、阻滞细胞周期于S期、激活AMPK-mTOR信号通路有关。

miR-21靶向PDCD4对舌鳞癌细胞上皮间质转化及侵袭能力的影响

目的:探究微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)靶向程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)对舌鳞癌细胞(tonguel squamous cell carcinoma,TSCC)上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及侵袭能力的影响。方法:qRT-PCR实验检测人口腔上皮细胞(human oral epithelial cell,HOEC)与舌鳞癌细胞系CAL-27中miR-21和PDCD4的表达水平。将miR-21 inhibitor阴性对照(NC inhibitor)、miR-21抑制剂(miR-21 inhibitor)转染至CAL-27细胞中,qRT-PCR实验检测miR-21的表达水平;采用CCK-8实验检测细胞增殖情况;采用划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;采用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;采用免疫印迹法(Western blot)和qRT-PCR实验评估PDCD4、EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)在蛋白和mRNA水平的表达情况。双荧光素酶报告基因实验验证miR-21与PDCD4的靶向关系。结果:CAL-27细胞中miR-21的表达明显高于HOEC细胞(P<0.001),而PDCD4表达低于HOEC细胞(P<0.001)。与对照组相比,抑制miR-21后miR-21的表达水平明显降低(P<0.001),并能显著抑制细胞的增殖、迁移、侵袭能力(P<0.05);抑制miR-21能上调CAL-27细胞中PDCD4(P<0.05)和E-cadherin(P<0.05)的表达,而下调N-cadherin(P<0.05)、Vimentin(P<0.01)、MMP-2(P<0.01)、MMP-9(P<0.01)蛋白和mRNA水平。双荧光素酶报告基因实验证明miR-21与PDCD4的靶向关系。结论:抑制舌鳞癌细胞中miR-21的表达能抑制其增殖、侵袭和上皮间充质转化,这可能与靶向激活和促进PDCD4的表达有关。

槲皮素对口腔鳞癌细胞增殖凋亡等细胞生物学行为及p38/JNK MAPK信号通路的影响

目的:探讨槲皮素对口腔鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及p38/JNK MAPK信号通路的影响。方法:以体外培养的口腔鳞癌Tac8113细胞为研究对象,分别设置空白对照组,槲皮素低剂量组(25μmoL/L)、高剂量组(50μmoL/L)及阳性对照组(顺铂4μg/mL)。CCK-8法检测槲皮素对口腔鳞癌Tac8113细胞增殖的影响;流式细胞仪检测槲皮素对口腔鳞癌Tac8113细胞凋亡的影响;Transwell实验检测槲皮素对口腔鳞癌Tac8113细胞迁移、侵袭的影响;WB法检测p38/JNK MAPK信号通路相关蛋白表达。结果:与空白对照组相比,槲皮素低、高剂量组及阳性对照组Tac8113细胞增殖活力、迁移数及侵袭数均下降,凋亡率增加(P<0.05);与槲皮素低剂量组相比,槲皮素高剂量组及阳性对照组Tac8113细胞增殖活力、迁移数及侵袭数均下降,凋亡率增加(P<0.05),呈现剂量依赖性;槲皮素高剂量组及阳性对照组Tac8113细胞增殖活力、迁移数、侵袭数及凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组相比,槲皮素低、高剂量组p-p38、p-JNK及Caspase-3蛋白表达增加(P<0.05);与槲皮素低剂量组相比,槲皮素高剂量组p-p38、p-JNK及Caspase-3蛋白表达增加(P<0.05),呈现剂量依赖性;空白对照组、槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组、阳性对照组p38、JNK蛋白表达差异不显著(P>0.05)。结论:槲皮素可以降低口腔鳞癌Tac8113细胞的增殖活力、迁移和侵袭数,诱导Tac8113细胞凋亡,这可能是通过激活p38/JNK MAPK信号通路实现的。

磷酸钙纳米颗粒介导干扰LMO4对皮肤鳞癌细胞增殖的影响

目的运用磷酸钙纳米颗粒包裹DNA转染皮肤鳞癌细胞,以靶向干扰LIM结构域蛋白4(LMO4)表达,探讨转录因子LMO4在皮肤鳞癌中作用和机制。方法采用逆转录-定量PCR技术(RT-qPCR)、免疫组织化学和蛋白质免疫印迹技术检测目的分子表达。利用经典方法制备磷酸钙纳米颗粒,包裹含有靶向干扰LMO4的shRNA表达载体,转染人皮肤鳞癌细胞A431。采用噻唑蓝(MTT)方法检测细胞增殖能力;运用流式细胞分析技术检测细胞周期变化。结果LMO4在皮肤鳞癌组织和A431细胞中高水平表达。磷酸钙纳米颗粒与DNA的最佳包裹比例为10∶1。此纳米颗粒包裹的DNA可以有效转染A431细胞并有效干扰LMO4表达,与脂质体转染后的干扰效率相比,差异无统计学意义(P=0.21)。在A431细胞中干扰LMO4后的24、36和48 h,细胞的增殖能力较对照组均显著降低。细胞周期分析显示:干扰组G_(0)/G_(1)期细胞为39.82%±1.86%,与对照组G_(0)/G_(1)期细胞(30.76%±1.96%)相比,差异有统计学意义(P=0.003);干扰组的S期细胞为39.56%±0.65%,与对照组的S期细胞(50.65%±0.62%)比较,差异有统计学意义(P=0.002)。干扰LMO4表达可以抑制细胞周期素蛋白E和周期素蛋白激酶2(CDK2)的表达。结论磷酸钙纳米颗粒能有效包裹DNA,并具有较高的转染效率;干扰LMO4表达可抑制细胞周期素蛋白E和CDK2的表达,抑制细胞增殖。

敲低膜联蛋白A2对食管鳞癌细胞恶性表型的抑制作用

目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲低膜联蛋白A2(ANXA2)基因的食管鳞癌细胞,研究该基因对食管鳞癌细胞表型的影响。方法:在公共数据库中查找ANXA2基因及对照的向导RNA(gRNA),选取6个ANXA2 gRNA及1个对照gRNA,使用CRISPR/Cas9载体构建表达ANXA2 gRNA的重组质粒,转入HEK293FT细胞制备gRNA/Cas9慢病毒,将慢病毒感染食管鳞癌KYSE30和KYSE150细胞后,使用嘌呤霉素筛选阳性细胞并扩大培养。采用Western blot检测ANXA2蛋白及其下游MYC蛋白的表达情况,逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ANXA2 mRNA表达情况,Transwell和集落形成实验分别检测细胞迁移侵袭和集落形成能力的变化。结果:成功构建了CRISPR/Cas9质粒;Sanger测序结果表明,ANXA2基因敲低质粒及对照质粒均构建成功。与对照组比较,病毒感染细胞后,Western blot结果显示,其中两个gRNA靶点病毒感染的KYSE30细胞中ANXA2蛋白及其下游MYC蛋白水平均显著降低(P<0.05);同时RT-qPCR结果证实,上述两个靶点显著下调ANXA2的mRNA表达水平(P<0.05)。Transwell和集落形成实验结果显示,敲低ANXA2后,细胞迁移侵袭能力和集落形成能力均显著减弱(P<0.05)。结论:ANXA2基因敲低显著抑制了食管鳞癌细胞的恶性表型,为进一步研究ANXA2促进食管鳞癌细胞恶性表型的作用机制提供了细胞模型和实验基础。

TCDD对人鳞癌细胞的乙氧基异吩恶唑-O-去乙基酶(EROD)诱导作用的观察

2,3,7,8-四氯二苯二氧芑(TCDD)为多氯代芳香烃类的一种高毒性化合物,对混合功能氧化酶系有特异的诱导作用。本文应用两株人舌鳞癌细胞株(SCC-15G,SCC-25)观察了TCDD对其乙氧基异吩噁唑-O-去乙基酶(EROD)的诱导作用。结果表明TCDD对SCC-15G与SCC-25细胞的EROD活性诱导作用明显,但以SCC-15G更为敏感。用10n MTCDD处理两株细胞后于不同时间观察酶活性的反应曲线。

双向凝胶电泳-飞行时间质谱法分析人肺鳞癌细胞NCI-H520蛋白质组成分

目的：建立和优化肿瘤蛋白质组研究的方法系统，并分析人肺鳞癌细胞蛋白质组。方法：用固相 ｐＨ梯度双向凝胶电泳分离人肺鳞癌细胞系ＮＣＩ－Ｈ５２０总蛋白，银染显色，ＰＤＱｕｅｓｔ ２ＤＥ软件分析，对部分蛋白质 点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｙｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱，用 ＰｅｐｔＩｄｅｎｔ软件查询 ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ数据库。结果：获得了分辨 率和重复性均较好的双向电泳银染图谱，图像分析探测到３块胶的平均蛋白质点数为（１１４６±１１６），平均匹配的点 数为（８５１±９５），匹配率达 ７３． ７％， ３ 块胶在蛋白质点位置上具有较好的重复性， ＩＥＦ方向的平均偏差为（１． ５２± ０．２２）ｍｍ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方向的平均偏差为（１．９７ ± ０．１３）ｍｍ。随机取６０个蛋白质点进行胶内原位酶解－质谱指纹图 分析得到了５４个蛋白质点的肽质指纹图，查询数据库初步鉴定了４４个蛋白质，其中部分是与细胞周期有关的蛋 白，部分是与信号传导有关的蛋白。

通幽汤对食管鳞癌细胞MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达的影响

目的:探讨通幽汤对食管鳞癌细胞基质金属蛋白酶2、9(MMP-2、MMP-9)及基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)的影响。方法:体外培养食管鳞癌KYSE150细胞,通幽汤全方作用于细胞,CCK-8实验检测细胞增殖变化,细胞划痕实验观察细胞迁移情况,Transwell法观察细胞侵袭情况,荧光显微镜观察细胞凋亡情况,ELISA法测定食管鳞癌细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9、TIMP-1含量,Western-blot法检测细胞MMP-2、MMP-9、N-钙黏联蛋白(N-cadherin)、TIMP-1、E-钙黏联蛋白(E-cadherin)表达量变化。结果:与对照组比较,研究组食管鳞癌细胞迁移速率和侵袭能力下降,MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白水平降低,TIMP-1、Ecadherin蛋白水平升高。结论:通幽汤可能通过调控食管鳞癌细胞侵袭和转移中的关键分子MMP-2、MMP-9、TIMP-1及钙黏联蛋白的表达,抑制癌细胞的侵袭和转移。

原代培养人喉鳞癌细胞中SIX1、TGF-β、VEGF-C表达的相关性

目的探讨原代人喉鳞癌细胞中SIX1、TGF-β、VEGF-C表达相关性。方法取新鲜人喉鳞状细胞癌组织,进行原代细胞培养,利用基因干扰技术,制备SIX1、TGF-β及SIX1+TGF-β靶向si RNA转染至人喉鳞癌细胞,转染成功后将实验细胞分为5组:A组(未转染组)、B组(转染空载体组)、C组(SIX1-si RNA组)、D组(TGFβ-si RNA组)、E组(SIX1+TGF-β-si RNA组)。Western blot及细胞爬片免疫荧光检测各组细胞SIX1、TGF-β及VEGF-C蛋白的表达。RT-PCR检测各组细胞SIX1、TGF-β及VEGF-C m RNA的表达。结果 SIX1、TGF-β、VEGF-C蛋白及其m RNA的表达在未转染组、转染空载体组中差异无统计学意义。同未转染组相比,SIX1蛋白及其m RNA的表达在SIX1-si RNA组降低的同时出现了VEGF-C表达的降低;TGF-β蛋白及其m RNA的表达在TGFβ-si RNA组降低的同时也出现了VEGF-C表达的降低,差异均有统计学意义。同SIX1-si RNA组、TGFβ-si RNA组相比,VEGF-C蛋白及其m RNA的表达在SIX1+TGF-β-si RNA组未出现进一步降低。结论 SIX1和TGF-β能够共同作用促进VEGF-C蛋白及其m RNA的表达,进而促进人喉鳞癌的淋巴转移。SIX1、TGF-β的变化可能成为临床抑制人喉鳞癌淋巴结转移的潜在靶点。

野黄芩苷对人舌鳞癌细胞的增殖抑制和Bcl-2蛋白表达的影响

目的:探讨野黄芩苷对人舌鳞癌细胞的增殖抑制作用及Bcl-2蛋白表达的影响。方法:用不同浓度的野黄芩苷处理体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞,用MTT法检测细胞增殖情况,Western-blot法检测Bcl-2蛋白表达情况。结果:野黄芩苷对Tca8113细胞的增殖有明显抑制作用,且在一定的时间和浓度范围内呈时间、浓度依赖性。Westerm-blot结果显示Bcl-2蛋白表达水平随野黄芩苷浓度的增大而逐渐下降。结论:野黄芩苷对人舌鳞癌细胞增殖具有明显的抑制作用,下调Bcl-2蛋白表达可能是野黄芩苷治癌的机制之一。

人外周血树突状细胞与人肺鳞癌细胞的融合研究

目的 探讨用杂交瘤技术制备树突状细胞疫苗的方法。研究树突状细胞 肿瘤细胞之融合细胞的形态及表型特征。 方法 用PEG法将免疫磁珠法分离获得的人外周血树突状细胞与人肺鳞癌细胞株LTEP78融合 ,瑞氏 姬姆萨染色观察树突状细胞、LTEP78细胞及其融合细胞的形态结构 ,SP免疫细胞化学染色法检测融合细胞的分子表达。 结果 分离的树突状细胞能高表达HLA DR分子 ,而LTEP78细胞则不表达 ;将树突状细胞与LTEP78细胞按 10∶1比例融合后 ,两者的细胞膜、细胞质依次融合 ,获得的融合细胞仍能表达HLA DR分子。 结论人树突状细胞与人肺鳞癌细胞的融合是一个动态过程 ,通过将两者融合 ,人肺癌细胞获得了人树突状细胞表达的HLA DR分子 ,从而增强了其免疫原性 ,为人树突状细胞疫苗的研制奠定了基础。

靶向抑制Rad50提高头颈部鳞癌细胞放疗敏感性的初步研究

目的:探讨靶向抑制Rad50对头颈部鳞癌细胞系放疗敏感性的影响。方法:用siRNA技术建立并筛选Rad50靶向抑制的Tca8113和OSCC-15稳转细胞系,联合应用单次小剂量放疗(2 Gy)处理细胞,Western blot检测Rad50的表达变化;通过Comet assay检测细胞核DNA的双链断裂情况,细胞克隆形成实验检测细胞存活分数的变化;Telomere FISH检测细胞端粒长度的变化。结果:与单次小剂量放疗(2 Gy)处理组相比较,Rad50靶向抑制联合放疗处理的Tca8113和OSCC-15稳转细胞系,Rad50蛋白表达显著降低,细胞核DNA的双链断裂损伤明显加重,细胞增殖速率明显减慢,细胞核内染色体端粒的长度均明显变短。结论:靶向抑制Rad50可以显著增强Tca8113和OSCC-15细胞的放疗敏感性。

乳杆菌代谢产物诱导人舌鳞癌细胞的凋亡作用

目的:考察植物乳杆菌代谢产物对人舌鳞癌细胞系CAL-27细胞增殖的抑制作用和诱导细胞凋亡的作用。方法:植物乳杆菌23201分别经复原乳清培养基和复原乳清菊糖培养基培养,制备相应的代谢产物1(LPM1)和代谢产物2(LPM2);用MTT法检测细胞增殖抑制作用;通过吖啶橙染色法检测凋亡细胞的形态学变化;采用琼脂糖凝胶电泳法检测细胞DNA片段。结果:不同浓度LPM1和LPM2分别作用CAL-27细胞24 h,最大抑制率分别达到(44.2±3.3)%和(41±4.1)%;荧光显微镜下观察,凋亡细胞的细胞核不规则,凝聚呈新月形或马蹄形;琼脂糖凝胶电泳显示出典型的"梯"状DNA条带。结论:植物乳杆菌代谢产物可以抑制CAL-27细胞的增殖,呈剂量依赖性关系,并诱导CAL-27细胞凋亡。

X线对舌鳞癌细胞系Tca8113端粒长度影响的动态观察

【目的】探讨放射线对人舌鳞癌细胞系Tca8113端粒长度变化的影响。【方法】采用流式原位杂交法(FLOW-FISH)检测Tca8113细胞的端粒相对长度(RTL)。【结果】与未照射细胞相比,经X线处理后,Tca8113细胞RTL值明显下降(P<0.05);在照射后1h至3h间,不同照射剂量的细胞RTL值均有一定程度上升;5h时,除2Gy组外,其它各照射剂量组的RTL值均下降。【结论】经X线照射后,Tca8113细胞端粒明显缩短。端粒缩短可能是放射损伤的机制之一。

不同浓度苦丁茶对TCA8113人舌鳞癌细胞的体外抗癌效果

对一种市售苦丁茶进行TCA8113人舌鳞癌细胞体外抗癌效果评价。通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)比色法实验、DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)荧光染色分析、RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)和Westernblot分析,研究其抗癌效果。通过MTT法测定苦丁茶对癌细胞体外生长抑制效果时发现,200μg/mL浓度的苦丁茶(75%癌细胞生长抑制率)对TCA8113人舌鳞癌细胞生长有相对最强的抑制效果。DAPI染色分析显示,与100、50μg/mL苦丁茶相比,使用200μg/mL浓度的苦丁茶,对TCA8113细胞有较强的诱其凋亡的能力。在RT-PCR和Westernblot分析结果中,凋亡因子Bax(B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x)、caspase-3(半胱天冬氨酸酶-3)、caspase-9(半胱天冬氨酸酶-9)的mRNA和蛋白质表达得到增强,Bcl-2(B细胞淋巴瘤/白血病基因-2)表达减弱。综合分析得出,一定浓度的苦丁茶具有良好的防癌抗癌效果。

重离子诱导人舌鳞癌细胞凋亡和Bax/Bcl-2蛋白表达的变化

探讨重离子辐照对人舌鳞癌Tb细胞的凋亡及Bax/Bcl-2蛋白表达的影响。采用0、0.5、1.0、2.0、4.0Gy重离子束辐照人舌鳞癌Tb细胞,应用MTT法检测细胞存活,流式细胞技术检测细胞周期变化,Hoechst 33258/PI复染法观察Tb细胞凋亡形态,并采用Western-blot法检测Bax/Bcl-2蛋白表达情况。结果发现,Tb细胞经12C6+离子束辐照后存活率显著下降,呈剂量依赖性的生长抑制;Tb细胞呈现蓝色荧光浓集成团的凋亡形态,且凋亡比例随辐照剂量增加;G2/M期细胞百分数随照射剂量增加而增加(P<0.05)。Western-blot结果显示Bax蛋白表达水平随辐照剂量逐渐上升,但在4Gy组其表达不再增高,Bcl-2蛋白在1.0、2.0、4.0Gy组随剂量增大呈下降趋势。以上结果提示重离子束辐照对Tb细胞有抑制作用,Bax/Bcl-2蛋白表达是重离子治癌的机制之一。