染色质解旋酶/ATP酶的DNA结合蛋白1样基因致瘤机制研究进展

染色质解旋酶/ATP酶的DNA结合蛋白1样基因(CHD1L)是一种新近被证实与在许多实体瘤中表达增多的致癌基因,它定位于第1号染色体q21区。CHD1L在肝细胞癌和其他肿瘤中的功能性研究提示,该基因在肿瘤形成过程中可以引起细胞增殖、调节G1/S过渡期并且可以抑制细胞凋亡。CHD1L活化的潜在机制可能是通过结合凋亡蛋白Nur77,或通过上调CHD1L调控的靶基因(如ARHGEF9、SPOCK1或TCTP)受体以激活蛋白激酶B通路,从而干扰细胞死亡程序。CHD1L目前已经被认为是一种新的可独立评价一些实体性肿瘤进展、预后以及生存率的生物标志物。现有的对CHD1L的认识在将来也许可以激励大家进行对一些特定肿瘤的靶向治疗研究。

融合蛋白TAT-RabGEF1原核表达载体的构建及蛋白表达

【目的】构建PET28a-TAT-RabGEF1重组质粒载体,在E.coli Rosetta(DE3)菌株中高效表达并纯化融合蛋白,研究TAT-RabGEF1融合蛋白对肥大细胞的跨膜转导活性。【方法】以小鼠组织cDNA为模板,设计上游和下游含有限制性酶切位点和TAT序列的引物,PCR扩增目的片段TAT-RabGEF1,并通过双酶切构建PET28a-TAT-RabGEF1重组质粒载体,在E.coli Rosetta(DE3)大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,产物用亲和层析柱纯化后测量浓度及鉴定。CCK-8检测融合蛋白的细胞毒性,并用荧光显微镜及荧光分光光度计定性定量观察其对小鼠肥大细胞瘤细胞P815的转导活性。【结果】成功构建了PET28a-TAT-RabGEF1重组载体,高效表达了具有较高特异性,相对分子质量约为57 ku的融合蛋白TAT-Rab GEF1,0.1、1、10μmol/L浓度的TAT-RabGEF1蛋白对细胞无明显毒性,荧光显微镜显示1μmol/L浓度的融合蛋白TAT-RabGEF1具有快速转导进入P815细胞内的能力,且为进入细胞的饱和浓度。【结论】通过TAT-RabGEF1的原核表达和蛋白纯化分析,证实了TAT-PTD的跨膜转导活性,为研究RabGEF1在肥大细胞激活途径中的作用提供了物质基础。

Epac1与神经性疼痛的研究进展

鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白1(Epac1)是一种新型的环腺苷酸传感器,调节细胞的几个关键过程,如Ca^(2+)调控、肌肉收缩、细胞分泌、离子通道传递、学习与记忆、细胞的生长和分化、凋亡和炎症。Epac1在神经性疼痛的进展中发挥关键作用,Epac1激活有助于神经性疼痛引起的异常性疼痛的进展,具体信号转导机制尚不清楚,可能与激活蛋白激酶C、丝裂原活化蛋白激酶以及Ca^(2+)内流有关。Epac1在神经疼痛的研究仅限于动物实验和细胞实验,未来有望在人体进行试验研究,使其成为治疗神经性疼痛的新靶点。

血府逐瘀胶囊通过调控Sirt3/EPAC1信号通路对动脉粥样硬化小鼠的影响

目的:观察血府逐瘀胶囊通过调控沉默信息调节因子3(Sirt3)/鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白1(EPAC1)信号通路对高脂饲料诱导的动脉粥样硬化小鼠血脂、主动脉斑块的影响,探讨血府逐瘀胶囊改善动脉粥样硬化的作用机制。方法:将小鼠分为正常组,模型组,空白组,瑞舒伐他汀组,血府逐瘀胶囊低、中、高剂量组,正常组用C57BL/6J正常小鼠,其余各组为同品系载脂蛋白E敲除(ApoE^(-/-))小鼠。正常组和空白组常规饲养,其余各组采用高脂饲料喂养,连续24周构建小鼠动脉粥样硬化模型,血府逐瘀胶囊以0.3、0.6、1.2 g·kg^(-1)·d^(-1)剂量灌胃,瑞舒伐他汀组以0.05 g·kg^(-1)·d^(-1)剂量灌胃,正常组、模型组和空白组给予等体积去离子水灌胃,连续灌胃6周。采用小动物B超仪评估小鼠心功能和主动脉斑块情况;全自动生化分析仪检测小鼠总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白(VLDL)等血脂指标;油红O染色观察主动脉脂质沉积情况;苏木素-伊红(HE)染色评估小鼠组织病理学改变;马松(Masson)染色观察小鼠血管内胶原沉积程度;透射电镜观察小鼠主动脉线粒体损伤情况;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测促肾上腺皮质激素(ACTH)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、烟碱型胆碱受体α1(CHRNα1)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)等指标;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测小鼠主动脉及心脏组织中Sirt3、EPAC1、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)mRNA相对表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Sirt3、EPAC1、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达。结果:模型组主动脉弓多处形成动脉粥样硬化斑块,提示造模成功;经血府逐瘀胶囊治疗后,与模型组比较,斑块明显缩小,斑块数量也明显减少。生化结果显示,与正常组比较,模型组CHOL含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,瑞舒伐他汀组、血府逐瘀胶囊低剂量组中CHOL和TG含量均显著降低(P<0.01)。油红O染色结果显示,与正常组比较,模型组主动脉血管壁上可见大量凸起的红色脂质斑块,其动脉粥样硬化斑块面积占组织总面积的百分比显著高于正常组(P<0.01);与模型组比较,血府逐瘀胶囊低剂量组斑块负荷明显减少(P<0.05)。与模型组比较,血府逐瘀胶囊各剂量组脂质斑块和胶原沉积显著减少。与正常组比较,模型组内皮细胞可见线粒体嵴减少或消失,膜结构损伤严重;各给药组血管内皮细胞线粒体形态趋近于正常结构,隐约可见线粒体嵴。与正常组比较,模型组小鼠心肌线粒体ATP活性显著下降(P<0.01),各给药组与模型组比较均有显著提高(P<0.01)。与正常组比较,模型组Sirt3含量显著降低(P<0.01),EPAC1的表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,血府逐瘀胶囊低剂量组Sirt3含量显著升高(P<0.01),血府逐瘀胶囊中剂量组EPAC1含量显著降低(P<0.01)。提示经血府逐瘀胶囊治疗后小鼠心脏组织的Sirt3蛋白及基因表达量明显升高,EPAC1的蛋白及基因表达量明显降低。结论:血府逐瘀胶囊可明显改善动脉粥样硬化小鼠血脂异常、主动脉脂质沉积、动脉粥样硬化斑块面积、内皮细胞线粒体形态和功能,增加ATP活性,提高Sirt3表达,同时抑制EPAC1的表达,其作用机制可能与通过调控Sirt3/EPAC1信号通路调节线粒体能量代谢有关。

益气活血方调控cAMP/Epac1/Rap1信号改善冠心病气虚血瘀证大鼠的验证

目的:基于环磷酸腺苷(cAMP)/环磷酸腺苷调节鸟嘌呤核苷酸交换因子1(Epac1)/Ras-同源蛋白1(Rap1)信号通路探讨益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠的心肌保护机制。方法:88只SPF级雄性SD大鼠,按随机数字表分为假手术组(n=12)和实验组(n=76),实验组大鼠采用限制饮食及力竭性游泳复合冠状动脉左前降支(LAD)结扎术构建冠心病气虚血瘀证模型,采集大鼠心电图,将造模成功后的实验组大鼠随机分为模型组、益气活血方低、中、高剂量组(4.28、8.55、17.1 g·kg^(-1))、西药组(单硝酸异山梨酯片,3.6 mg·kg^(-1)),连续给药4周;假手术组及模型组灌胃等体积双蒸水。末次给药后24 h取材,行心脏超声检测左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD),左室短轴缩短率(FS)、射血分数(EF),腹主动脉采血行血液流变学测定,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血浆cAMP水平;留取心肌组织进行苏木素-伊红(HE)染色、马松(Masson)染色观察心肌病理损伤情况,透射电镜观察心肌组织超微结构改变;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测心肌Epac1、Rap1GTP酶激活蛋白(Rap1GAP)及Rap1 mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测心肌Epac1、Rap1GAP及Rap1蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠的LVEDD、LVESD显著增加(P<0.01),EF及FS比率显著下降(P<0.01),表现出心功能减退的“心气虚”症状;全血黏度及血浆黏度显著升高(P<0.01),cAMP含量显著升高(P<0.01),心肌组织胶原纤维显著增生(P<0.01),心肌超微结构受损严重,表现出“血瘀”的病理改变;Real-time PCR结果显示模型组大鼠Epac1及Rap1 mRNA显著降低(P<0.01),Rap1GAP mRNA显著增加(P<0.01);Western blot显示Epac1蛋白表达显著降低(P<0.01),Rap1GAP蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型组比较,益气活血方能改善冠心病气虚血瘀证大鼠心功能、降低血液黏度、降低血浆cAMP含量、减少胶原纤维增生,改善心肌超微结构损伤,以高剂量组作用效果最佳。益气活血方高剂量组能显著增加Epac1 mRNA及蛋白表达(P<0.01),显著增加Rap1 mRNA表达(P<0.01),明显降低Rap1GAP mRNA及Rap1GAP/Rap1蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:益气活血方可改善冠心病气虚血瘀证大鼠心功能、降低血液黏度与血浆cAMP含量、改善心肌损伤、减少胶原纤维增生,其心肌保护机制可能与调节cAMP/Epac1/Rap1信号通路有关。

蓝萼甲素诱导胶质瘤细胞凋亡及其上调GEF-H1的作用机制

蓝萼香茶菜[Rabdosia japonica (Burm. f.) Hara var. glaucocalyx (Maxim.) Hara]是中国民间草药,具有抗肿瘤活性。此研究的目的是探讨蓝萼甲素(glaucocalyxin A,GLA),一种从蓝萼香茶菜中分离纯化得到的二萜类化合物,诱导胶质瘤细胞凋亡的作用及其机制。通过检测C6大鼠胶质瘤细胞的存活率及干扰核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和蛋白质免疫印迹(Westernblot)技术以探究细胞凋亡的分子信号机制。当GLA存在时,C6大鼠胶质瘤细胞的存活率明显降低,鸟嘌呤核苷酸交换因子H1(guanine nucleotide-exchange factor,GEF-H1)表达上调,引起细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)蛋白磷酸化,造成细胞凋亡。因此,GLA诱导神经胶质细胞凋亡是通过激活GEF-H1/ERK途径。

神经上皮细胞转化因子的分子功能及研究现状

神经上皮细胞转化因子1(Net-1)是由595个氨基酸组成的蛋白质,属于鸟嘌呤核苷酸交换因子家族中的一员,是一种鸟嘌呤核苷酸调节蛋白,具有激活和调节Ras基因同源家族Rho家族成员的功能。Net-1在信号传导、细胞粘附、迁移、增殖、分化和肿瘤生长等一系列生理病理过程中发挥着重要作用。本文主要介绍Net-1分子功能及研究现状。