鸟氨酸脱羧酶抗酶1基因的结构和功能

鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)基因可通过特殊的+1移码机制翻译全长的功能蛋白。研究发现,OAZ1能与鸟氨酸脱羧酶(ODC)结合并降解ODC,负调控细胞内多胺的水平;OAZ1还能降解Cyclin D1、Cyclin E1和Smad1周期蛋白,阻滞细胞周期;此外,近年来研究表明,OAZ1还具有抗肿瘤效应和调控动物繁殖的功能。抗酶抑制因子能竞争性结合ODC-OAZ1复合体中的OAZ1,从而阻止ODC降解;天门冬酰胺也能通过抑制OAZ1的翻译来调节ODC的活性。本文就OAZ1基因结构和功能的研究现状作一综述。

人鸟氨酸脱羧酶抗酶1突变基因的克隆与原核表达

克隆人鸟氨酸脱羧酶抗酶1(Homo sapiensornithine decarboxylase antizyme 1,HOAZ1)开放性阅读框+1核糖体移码位点缺失的突变基因,构建突变基因的原核表达质粒,分离纯化其原核表达的重组蛋白。采用巢式-PCR和重叠延伸-PCR技术,从人非小细胞肺癌细胞株A549的cDNA中获得人类鸟氨酸脱羧酶抗酶1开放性阅读框+1核糖体移码(+1RF)位点缺失突变的基因序列(DM-HOAZ1)。将该序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)后,转化表达菌Rosseta(DE3)感受态细胞。阳性克隆用IPTG诱导重组蛋白表达,然后在尿素变性条件下经Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组HOAZ1。原核表达和纯化的HOAZ1重组蛋白用Western Blot鉴定。结果显示,成功获得HOAZ1开放阅读框中+1RF位点缺失的突变基因和该突变基因的原核表达质粒pET-28a(+)/DM-HOAZ1;用pET-28a(+)/DM-HOAZ1转化大肠杆菌后,HOAZ-1可被IPTG诱导性高表达,且表达量随诱导时间延长递增;原核表达的HOAZ1可用Ni-NTA树脂亲和层析有效纯化。建立了原核表达和分离纯化HOAZ1蛋白的试验方法,为进一步研究HOAZ1的功能和临床应用奠定了基础。

小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1功能基因的克隆及原核表达

目的克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白。方法采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重叠PCR法扩增出692bp的OAZ1功能基因,重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,重组蛋白可在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。纯化的重组蛋白纯度可达79.96%,且可与抗His标签抗体特异性结合。结论已成功克隆了小鼠OAZ1功能基因,原核表达并纯化了重组OAZ1蛋白。

鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1高表达抑制黑素瘤细胞在小鼠体内的生长

鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antienzyme inhibitor-1,OAZI-1)是细胞内调节多胺代谢的重要蛋白质因子。已有研究发现,OAZI-1高表达的黑素瘤细胞在体外能更有效地被抗原提呈细胞识别和吞噬,提示OAZI-1在肿瘤免疫治疗中具有潜在的应用价值。为进一步分析OAZI-1高表达对黑素瘤细胞在小鼠体内生长的影响,高表达OAZI-1的黑素瘤细胞(B16/OAZI-1)被接种到实验小鼠体内,结果发现,接种瘤出现先成瘤随后逐渐消退的现象,至第24 d时,接种瘤的平均体积为36±25 mm3~,而对照细胞接种瘤的平均体积为326±309 mm^3。为探索上述现象的机制,随后分析了B16/OAZI-1在小鼠体内诱导的抗肿瘤免疫效应,结果发现:1)B16/OAZI-1接种显著增加了小鼠脾脏细胞对B16-F1瘤细胞的杀伤活性;2)源于B16-F1的细胞抗原能更有效地促进B16/OAZI-1接种小鼠脾脏细胞的增殖;3)B16/OAZI-1接种小鼠的脾脏细胞具有更强的分泌IFN-γ的能力;4)当在预接种B16/OAZI-1 30 d后的小鼠体内再次接种B16-F1活细胞时,新接种瘤细胞的生长受到显著抑制,小鼠的存活率增加。上述研究结果提示,高表达OAZI-1的黑素瘤细胞在实验动物体内的生长受到显著抑制,其机制可能与OAZI-1能促进肿瘤抗原提呈和诱导抗肿瘤免疫效应相关。

siRNA干扰鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1的表达抑制黑素瘤细胞增殖

目的:研究siRNA干扰鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)的表达对小鼠黑素瘤B16-F1细胞增殖的影响。方法:构建OAZI-1特异性siRNA表达质粒psilencer2.1-U6/OAZI-1及对照psilenc-er2.1-U6/scrambled质粒,脂质体转染法将质粒转染入B16-F1细胞,Western blotting和定量PCR检测B16-F1细胞中OAZI-1的表达。MTT法和流式细胞术检测psilencer2.1-U6/OAZI-1对B16-F1细胞增殖和细胞周期的影响;MTT法检测干扰OAZI-1表达后B16-F1细胞对抗肿瘤药物紫杉醇(docetaxel)的敏感性。结果:成功获得稳定转染psilencer2.1-U6/OAZI-1质粒的B16-F1细胞(B16/OAZI-1细胞),B16/OAZI-1细胞中OAZI-1 mRNA和蛋白表达分别为阴性对照B16/scrambled细胞的25.0%和18.9%。干扰OAZI-1的表达抑制B16-F1细胞的增殖,G0/G1期细胞比例增加[(57.0±0.8)%vs(63.5±0.7)%,P<0.01],而S期和G2/M期细胞比例减少[(31.5±0.7)%vs(27.5±0.3)%,P<0.05;(11.5±0.3)%vs(9.1±0.6)%,P<0.01]。干扰OAZI-1的表达能降低B16-F1细胞对紫杉醇的敏感性。结论:siRNA干扰OAZI-1的表达能抑制黑素瘤B16-F1细胞的增殖,并降低其对紫杉醇的敏感性。

鸟氨酸脱羧酶抗酶-1过表达促进非小细胞肺癌细胞系A549凋亡

目的探讨上调鸟氨酸脱羧酶(ODC)抗酶-1(AZ-1)对非小细胞肺癌细胞系A549多胺代谢酶表达和细胞凋亡的影响。方法制备靶向提高人源性AZ-1表达的pcDNA3.1-HOAZ-1质粒,用其与空载质粒pcDNA3.1(-)分别转染A549细胞,并设立未经任何处理的空白对照组,48 h后分别收集总RNA和蛋白质,通过反转录聚合酶链反应和蛋白质印记分析分别检测AZ-1、ODC和鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制剂-1(AZIN-1)的表达;同样的处理条件下应用流式细胞计量术检测细胞凋亡。结果在转染pcDNA3.1-HOAZ-1质粒后,ODC表达被明显抑制,AZIN-1的表达调节不明显;过表达AZ-1引起细胞凋亡增加(P<0.05)。结论过表达AZ-1能抑制ODC表达和促进A549细胞凋亡。

高表达OAZI-1的小鼠乳腺癌4T1细胞诱导抗肿瘤免疫应答的实验研究

目的在细胞和实验动物水平上分析高表达OAZI-1对小鼠乳腺癌4T1细胞诱导抗肿瘤免疫应答的影响。方法RT-PCR和Western blot用于鉴定高表达OAZI-1的4T1细胞(4T1/OAZI-1);流式细胞仪检测Mφ下同和DC对4T1细胞的吞噬率以及成熟DC标志性表面分子的表达水平;ELISA检测细胞培养上清和小鼠血清中IFN-γ和TNF-α含量。用4T1/OAZI-1和4T1/3.1对照细胞分别接种Balb/c小鼠后,观察接种瘤的生长状况及荷瘤小鼠的生存期。结果1)成功构建OAZI-1高表达的4T1/OAZI-1细胞株;2)M?和DC对4T1/OAZI-1细胞的吞噬率(10.8%,58.4%)显著高于对照细胞(6.3%,19.6%);3)将DC与4T1/OAZI-1共孵育后,CD40、CD80和CD86(成熟DC细胞表面标志分子)表达阳性的DC比率(62.8%、77.9%和75.1%)显著高于和对照细胞共孵育的DC(43.9%、57.5%和49.6%);4)将4T1/OAZI-1活化的DC与Balb/c小鼠脾淋巴细胞共孵育后,细胞培养上清中IFN-γ含量(28.7 pg/ml)显著高于对照细胞(19.4 pg/ml);5)将4T1/OAZI-1和4T1/3.1细胞分别接种Balb/c小鼠右前肢腋窝皮下,小鼠体内4T1/OAZI-1接种瘤的生长速度显著低于对照细胞接种瘤,其生存期和血清TNF-α和IFN-γ水平也明显高于接种对照细胞的小鼠。结论高表达OAZI-1的小鼠乳腺癌4T1细胞能更有效地被抗原提呈细胞识别、吞噬并诱导T淋巴细胞活化与成熟,诱导机体的抗肿瘤免疫应答,抑制接种瘤在动物体内的生长。

鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1与细胞增殖

多胺(腐胺、精脒、精胺)参与细胞增殖、分化和凋亡等重要生命过程,细胞内多胺代谢紊乱也与包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展密切相关。鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(antizyme inhibitor-1,AZIN1)是重要的多胺代谢调节蛋白,它通过多种途径调控细胞的生长。AZIN1能与鸟氨酸脱羧酶抗酶(antizyme,AZ)相互作用,解除后者对多胺合成限速酶鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)的抑制,由此上调细胞内多胺的含量。AZIN1还能通过调节细胞周期蛋白cyclin D1的降解速度和干扰细胞中心体复制而影响细胞增殖。AZIN1基因转录后修饰和某些特定mi RNA也对AZIN1的细胞增殖调节功能有重要影响。现对该研究领域的研究进展做简要综述。

AZIN-1小分子抑制剂抗非小细胞肺癌活性研究

目的研究鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(AZIN-1)小分子抑制剂对非小细胞肺癌的抑制作用及机制。方法通过CCK-8法检测A549细胞增殖;流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双染)分析A549细胞凋亡;蛋白质免疫印迹实验检测A549细胞内鸟氨酸脱羧酶(ODC)、鸟氨酸脱羧酶抗酶-1(AZ-1)和AZIN-1的表达;流式细胞术(PI单染)分析A549细胞周期;高效液相色谱法检测A549细胞内总多胺含量。结果AZIN-1小分子抑制剂能够显著抑制A549细胞的增殖,使细胞发生G0/G1周期阻滞,并诱导A549细胞发生凋亡,显著抑制AZIN-1和ODC的表达,干扰细胞内多胺代谢,降低细胞内总多胺含量。结论AZIN-1小分子抑制剂对A549细胞具有显著的生长抑制作用,其作用机制可能与诱导细胞凋亡和干扰多胺代谢有关。

OAZI-1蛋白复合物在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤效应的研究

目的:在实验动物的水平上分析来源于肿瘤细胞的鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(Ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)蛋白复合物能否在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤效应。方法:用包被有OAZI-1抗体的免疫磁珠从B16-F1小鼠黑色素瘤细胞中分离OAZI-1蛋白复合物,用此复合物免疫小鼠后,再在小鼠皮下接种B16-F1活细胞,然后观察接种瘤在小鼠体内的成瘤及生长状况。ELISA法用于检测免疫小鼠血清中IFN-γ含量。乳酸脱氢酶释放实验(LDH)检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞对B16-F1细胞的杀伤效应。上述动物实验用原核表达纯化的OAZI-1蛋白和PBS免疫的小鼠作为对照。结果:与对照小鼠相比,接种OAZI-1蛋白复合物的小鼠脾淋巴细胞(效应细胞)对B16-F1黑素瘤细胞(靶细胞)具有更强的杀伤能力。在三种不同的效∶靶比下(10∶1、50∶1、100∶1),该组小鼠脾淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性分别为46.2%、59.5%和92.5%,显著性高于接种纯化OAZI-1蛋白组(36.1%、26.8%和45.9%)和接种PBS组(24.6%、24.0%和27.2%)小鼠脾淋巴细胞。此外,接种OAZI-1蛋白复合物的小鼠血清中抗肿瘤细胞因子IFN-γ含量(538.3 pg/ml)也显著性高于接种纯化OAZI-1蛋白组(256.2 pg/ml)和接种PBS组(131.0 pg/ml)小鼠。上述方法免疫的小鼠在皮下再接种B16-F1活细胞后,免疫OAZI-1蛋白复合物组小鼠成瘤率为40%,而PBS组和纯化OAZI-1蛋白组小鼠成瘤率为100%,且接种瘤在OAZI-1蛋白复合物免疫小鼠体内生长更为缓慢。结论:从B16-F1肿瘤细胞中分离的OAZI-1蛋白复合物中可能含有肿瘤抗原,用此复合物接种小鼠能在实验动物体内诱导抗肿瘤免疫杀伤活性。

产蛋前期和产蛋期鹅HPG轴OAZ1和OAZ2基因表达的研究

【目的】探讨产蛋前期和产蛋期鹅HPG轴中OAZ1和OAZ2基因表达的差异。【方法】选取健康的产蛋前期和产蛋期四川白鹅母鹅各3只,采集下丘脑、垂体和卵巢组织样品,提取总RNA并反转录合成cDNA,应用实时荧光定量PCR检测产蛋前期和产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体、卵巢组织中OAZ1和OAZ2基因的相对表达量。【结果】在产蛋前期和产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体和卵巢组织中,OAZ1和OAZ2基因均有表达,并且产蛋期OAZ1和OAZ2表达量均极显著高于产蛋前期(P<0.01),产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体和卵巢中OAZ1的表达量分别是产蛋前期的1.79倍(P<0.01)、2.96倍(P<0.01)和3.48倍(P<0.01);产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体和卵巢中OAZ2的表达量分别是产蛋前期的2.66倍(P<0.01)、1.38倍(P<0.01)和2.03倍(P<0.01)。【结论】OAZ1和OAZ2可在HPG轴的各级水平发挥其调控鹅繁殖过程的功能,OAZ1主要参与卵巢功能的调控,而OAZ2主要参与下丘脑功能的调控。

OAZI-1增强小鼠Melan-A疫苗免疫原性

目的探讨鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制剂-1(OAZI-1)能否增强Melan-A疫苗的免疫原性,进而诱导实验动物体内更强的细胞免疫效应。方法构建真核表达质粒pc DNA3.1(-)/OAZI-1、pc DNA3.1(-)/Melan-A及pc DNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1。将真核表达质粒作为基因疫苗免疫BALB/c小鼠,收集小鼠脾脏淋巴细胞及血液,用流式细胞计量术检测淋巴细胞亚群的变化;用乳酸脱氢酶(LDH)释放分析法检测脾淋巴细胞的肿瘤杀伤活性;用ELISA分析法检测血清INF-γ水平。结果成功构建了真核表达质粒pc DNA3.1(-)/OAZI-1、pc DNA3.1(-)/Melan-A及pc DNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1;将真核表达质粒作为基因疫苗免疫小鼠后,小鼠脾脏CD4+T细胞比率显著性升高(P<0.05),其中以pc DNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1免疫组和pc DNA3.1(-)/Melan-A免疫组升高更为明显(二者之间无显著性差异);上述3种基因疫苗接种小鼠后,CD8+T细胞比率也显著性升高(p<0.05),但以pc DNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1免疫组升高最为显著,与所有其他组相比均有显著性差异(P<0.05);用pc DNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1免疫小鼠能显著增加脾淋巴细胞的肿瘤杀伤活性(P<0.05);上述3种基因疫苗免疫小鼠后,仅pc DNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1组小鼠血清中INF-γ含量显著性升高(P<0.01)。结论 OAZI-1能通过促进肿瘤抗原提呈,增加机体的抗肿瘤免疫能力。

OAZ1基因诱导慢粒白血病K562细胞向成熟红系方向分化

近年来,鸟氨酸脱羧酶抗酶(OAZ)作为肿瘤治疗的潜在靶点备受关注.本文研究了OAZ1基因过表达对慢粒白血病K562细胞红系分化的作用.构建框移位点突变的OAZ1过表达慢病毒载体pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen,包装病毒并感染K562细胞,Western印迹验证其过表达效果.FACS检测细胞分化标志物CD71和GPA,结合联苯胺染色分析细胞红系分化情况.对比氯化高铁血红素(hemin)诱导组,实时RT-PCR检测与K562细胞红系分化、癌变的关键基因(GATA1、BCR/ABL、TGFβ)转录水平,对OAZ1诱导分化的机制进行初步探索.结果表明,慢病毒过表达载体及K562细胞过表达体系构建成功.OAZ1过表达后细胞红系分化标志物CD71+/GPA+为(11.22±2.09)%,与对照组(4.07±1.04)%、空病毒组(1.79±2.36)%相比差异极显著(P<0.01);联苯胺蓝染阳性率为(14.037±0.083)%,与对照组、空病毒组比较,差异也极显著(P<0.01).定量分析结果提示,相对于GATA1、BCR/ABL基因mRNA转录水平的影响,OAZ1对TGFβ基因的作用更为明显.为此推断,OAZ1基因可诱导白血病K562细胞向成熟红系方向分化,其作用机制可能与TGFβ信号转导通路相关.

原发性血小板增多症患者多胺合成酶与多胺代谢酶表达特点研究

目的探讨原发性血小板增多症(ET)患者多胺合成酶与多胺代谢酶的表达特点。方法将喀什地区第一人民医院与南方医科大学珠江医院血液内科自2020年11月至2022年9月收治的27例ET患者设为研究组。另选取同期于两家医院体检的28例健康志愿者设为健康组。收集两组研究对象的骨髓细胞,分离单个核细胞后提取总mRNA。采用逆转录聚合酶链式反应测定并比较两组鸟氨酸脱羧酶1(ODC1)、精胺氧化酶(SMOX)、鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)和鸟氨酸脱羧酶抗酶2(OAZ2)的相对表达量。1例研究组患者血栓情况失访。根据是否发生血栓,将研究组患者分为非血栓亚组(n=18)与血栓亚组(n=8)。采用二元Logistic回归分析法检验ET发生与ODC1、SMOX、OAZ1相对表达量的相关性。采用二元Logistic回归分析法(向前:有条件法)检验ET患者发生血栓与ODC1、OAZ1、OAZ2相对表达量的相关性。结果研究组的ODC1、SMOX、OAZ1相对表达量均低于健康组,差异均有统计学意义(P<0.05)。二元Logistic回归分析结果显示,ET与ODC1相对表达量存在负相关性(β=-1.481,P<0.05)。血栓亚组患者ODC1、OAZ1相对表达量均低于非血栓亚组,OAZ2相对表达量高于非血栓亚组,差异均有统计学意义(P<0.05)。二元Logistic回归分析法(向前:有条件法)结果显示,ET患者发生血栓与OAZ2相对表达量存在正相关性(β=0.234,P<0.05)。结论多胺的合成下降可能与ET发生相关,而多胺水平下降可能与ET患者发生血栓相关。