普通烟草鸟氨酸转氨酶基因Ntδ-OAT的克隆与表达分析

鸟氨酸转氨酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸的关键酶,对植物适应逆境胁迫起关键作用。本研究根据其已知保守序列设计兼并引物,从普通烟草品种中烟14中克隆到一条425bp的中间片段,应用RACE方法设计特异性引物扩增得到5′末端和3′末端cDNA序列,经BLAST验证,首次从普通烟草中克隆到了鸟氨酸转氨酶基因,命名为Ntδ-OAT,其GenBank登录号为GU144571。该基因cDNA全长为1781bp,共编码477个氨基酸。系统进化树分析显示,Ntδ-OAT基因的进化符合传统的生物学分类,主要功能域在生物进化中保守性较高。Real-time PCR分析表明,Ntδ-OAT基因受干旱、高盐、低温、ABA等多种胁迫处理的诱导表达,可能参与普通烟草体内抗渗透胁迫过程。

甘蔗水分胁迫响应的δ-鸟氨酸转氨酶基因克隆及分子特征分析

通过消减文库技术,结合cDNA芯片技术筛选到1个明显受水分胁迫诱导的EST序列(Ratio值为8.1),比对分析推测其为δ-OAT基因的片段,进而通过RACE结合PCR技术获得该基因全长cDNA序列为1782bp,其中5′端非编码区150bp,开放阅读框为1362bp,3′端非编码区为270bp且存在2个终止加A信号AATAA。预测其编码的蛋白质分子量为49.5ku,等电点为6.5,为一个跨膜蛋白。序列比对分析结果表明,δ-OAT基因家族N末端和C末端相对不保守,而主要功能区均表现保守。基因进化分析显示,单子叶禾本科植物和双子叶植物鸟氨酸转氨酶编码基因分别由各自祖先进化而来,而微生物的鸟氨酸转氨酶编码基因表现出复杂的进化关系。荧光实时PCR分析δ-OAT在根、茎、叶的表达,该基因在茎的表达较高,其次是叶而后为根,但没有明显的组织表达特异性。本文首次报道甘蔗δ-OAT基因克隆研究结果,为该基因的深入研究和应用奠定一定基础。

日本血吸虫鸟氨酸转氨酶基因的获得和分析

目的运用表达序列标签(expressedsequencetag,EST)技术,从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选和鉴定日本血吸虫新基因鸟氨酸转氨酶。方法转化日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,获得EST;用NCBI站点的GenBank对所获得的新基因序列进行同源性检索;利用BLAST程序对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较;并利用pc-gene软件对其蛋白质结构进行初步分析。结果获得了1个日本血吸虫新基因鸟氨酸转氨酶基因(GenBank登录号AY336497)。该cDNA序列长1677bp,编码424个氨基酸,与Xenopuslaevis鸟氨酸转氨酶同源性为66%;编码蛋白的理论等电点为8.52;抗原表位可能位于cDNA序列795～846处。结论用EST寻找日本血吸虫新基因是一种可行的方法,所筛选到的日本血吸虫新基因与Xenopuslaevis鸟氨酸转氨酶基因同源,为进一步研究该基因的全序列及功能作准备。

集胞藻PCC6803中N-乙酰鸟氨酸转氨酶的生化表征及结构分析

旨在对集胞藻PCC6803中slr1022基因编码的N-乙酰鸟氨酸转氨酶进行生化表征及结构分析,为进一步研究该酶的催化功能及机制奠定理论基础。以集胞藻PCC6803基因组为模板,通过PCR扩增获得slr1022基因,将其连接到表达载体pET-28a上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态。经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化后获得重组Slr1022蛋白,然后通过紫外分光光度法对Slr1022蛋白的催化功能进行表征,并运用生物信息学软件对该蛋白进行结构分析。成功构建pET28a-slr1022重组表达质粒,并诱导表达重组Slr1022蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定该蛋白分子量约为50 kD,与理论大小相符。Slr1022蛋白与底物N-乙酰鸟氨酸的结合常数K_m和最大反应速度V_(max)分别是0.12 mmol/L和0.60 μmol/(L·s),并且Slr1022蛋白与另一底物α-酮戊二酸的K_(m)和V_(max)分别是0.039 mmol/L和0.65 μmol/(L·s)。Slr1022蛋白在pH 8.5时催化活性最强。Slr1022蛋白和其他来源的N-乙酰鸟氨酸转氨酶氨基酸序列有一定的同源性,而且活性位点的氨基酸残基高度保守。成功克隆并表达纯化出Slr1022蛋白,酶学性质和生物信息学研究表明Slr1022蛋白为N-乙酰鸟氨酸转氨酶。

斑茅-δOAT基因克隆及其序列分析

利用RT-PCR和RACE技术从斑茅(Erianthus arundinaceus)中分离出编码鸟氨酸-δ-氨基转氨酶基因的全长cDNA序列,序列全长1 680 bp,编码454个氨基酸。通过对哺乳动物、高等植物、微生物的-δOAT基因编码的氨基酸序列进行同源比对,发现斑茅-δOAT基因同其近缘属植物甘蔗的同源性最高(87%),同其他高等植物的同源性次之(约为70%),而同动物的同源性最低(约为60%)。在斑茅-δOAT基因编码的氨基酸序列的5′端未发现线粒体定位序列,同甘蔗-δOAT基因一样。斑茅-δOAT基因具有完整的鸟氨酸转氨酶功能区rocD。利用定量RCR(real-tim e PCR)对30%PEG胁迫下的斑茅-δOAT基因表达量进行研究,结果表明-δOAT基因在胁迫12 h表达量达到最高,约为对照的4.1倍;胁迫2 h-δOAT基因表达量反而有所降低。

门冬氨酸鸟氨酸治疗亚临床肝性脑病的临床对照研究

目的 :观察门冬氨酸鸟氨酸治疗亚临床肝性脑病的临床疗效及安全性。方法 :39例肝硬化亚临床肝性脑病患者随机分成两组 ,治疗组 2 1例 ,用门冬氨酸鸟氨酸 10克 /日 ,持续 3天。对照组 18例 ,予以肌苷、维生素等普通治疗。观察治疗前后总胆红素 (TBIL)、谷丙转氨酶 (ALT)、血氨及数字连接试验 (NCT)等指标变化。结果 :门冬氨酸鸟氨酸降低血氨和数字连接试验的时间明显优于对照组 (P <0 0 5 )。且副反应小。但总胆红素和谷丙转氨酶变化与对照组比较无明显差异。结论

人体血清鸟氨酸氨基甲酰转移酶正常值测定

本文报道126例献血员血清鸟氨酸氨基甲酰转移酶(SOCT)活性测定。用本法测定SOCT活性灵敏度与精确度高,重现性好,测得的SOCT正常值范围可靠、根据国外资料报道,SOCT作为肝脏病的酶学诊断指标,比SGPT和SGOT灵敏度高,特异性强。

门冬氨酸鸟氨酸联合纳洛酮治疗急性酒精中毒患者的疗效分析

目的探讨门冬氨酸鸟氨酸联合纳洛酮治疗急性酒精中毒患者的疗效。方法选取我院2016年3月至2017年9月诊治的急性酒精中毒患者96例为研究对象,按随机数字表法分成对照组和研究组,每组48例。两组患者均给予吸氧、输液、保暖、外伤处理等基础治疗。在基础治疗上,对照组患者给予纳洛酮0.4~0.6 mg静脉滴注治疗;研究组患者在对照组患者治疗的基础上给予门冬氨酸鸟氨酸5~10 g静脉滴注治疗。比较两组患者的临床疗效,两组患者兴奋期、共济失调期、昏迷期症状消失时间及意识完全恢复时间,检测比较两组患者血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平,观察比较两组患者呼吸抑制加重、呕吐、心动过快、嗜睡、烦躁不安等不良反应发生情况。结果研究组患者的治疗总有效率为95.83%,对照组为77.08%;研究组患者的临床疗效优于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。研究组患者兴奋期、共济失调期、昏迷期症状消失时间及意识完全恢复时间均显著短于对照组(P<0.01)。治疗后,研究组患者血清ALT、AST水平均明显降低,且显著低于对照组(P<0.01)。研究组患者不良反应发生率(4.16%)显著低于对照组为(20.83%),差异有统计学意义(P<0.01)。结论门冬氨酸鸟氨酸联合纳洛酮治疗急性酒精中毒患者能促进患者意识恢复,有效减轻肝损伤,临床疗效显著,治疗安全性高。

的茶树鸟氨酸转氨酶基因CSδ-OAT克隆与表达分析

根据已知鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)的保守序列设计简并引物,并利用RT-PCR和RACE技术从‘迎霜’茶树中克隆获得鸟氨酸转氨酶基因,命名为Csδ-OAT,其Gen Bank登录号为KJ641844。该基因c DNA全长为1 865 bp,编码473个氨基酸,理论等电点为7.19,推测分子量为52.3 k D。序列比对分析结果表明,Csδ-OAT主要功能域保守性较高,存在典型的PLP结合位点;系统进化树分析显示,Csδ-OAT的进化符合传统的生物学分类,与其他双子叶植物具有同一起源。q RT-PCR分析结果表明,Csδ-OAT基因的表达存在明显的组织特异性,在花中表达最高,其次是叶片,而在其他组织器官中表达较低。此外,Csδ-OAT基因受高盐、低温、干旱、ABA和氧化胁迫处理的诱导,表明其参与了茶树体内各种非生物胁迫响应的过程。

水稻脯氨酸代谢关键酶对水分胁迫的响应

以二叶期水稻幼苗为试验材料,研究其在15%PEG6000模拟的水分胁迫下脯氨酸积累及代谢关键酶活性变化,结果表明:叶片和根系中脯氨酸含量在胁迫后快速积累,胁迫24 h达到最大值,随后逐渐降低;控制脯氨酸合成的关键酶吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)活性都呈现先升后降的变化趋势,而控制脯氨酸降解的关键酶脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性呈现先降后升的变化趋势。

渗透胁迫下硝酸钾对烟草脯氨酸代谢途径的影响

为研究硝酸钾对渗透胁迫下烟草脯氨酸代谢途径的影响,利用聚乙二醇(PEG)胁迫烟草,测定胁迫条件下,经过不同浓度硝酸钾处理后烟草叶片的相关生理指标,重点测定了烟草叶片中脯氨酸含量及脯氨酸代谢途径中吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)、鸟氨酸转氨酶(OAT)和脯氨酸脱氢酶(PDH)的活性。结果表明,外加2 mmol.L-1KNO3可以显著增加叶绿素a含量、b含量和相对含水量,显著降低丙二醛含量、细胞膜相对透性,有效缓解PEG胁迫对烟草叶片的伤害。胁迫条件下硝酸钾可以增加烟草叶片中的脯氨酸含量。推测PEG胁迫显著促进脯氨酸累积可能是因为胁迫增强了谷氨酸途径中P5CS活性,PEG胁迫下硝酸钾促进脯氨酸累积则可能是因为硝酸钾增强了鸟氨酸代谢途径中OAT活性。

香稻香气形成的生理特性初步研究

以非香稻品种华粳籼74为对照,对4个不同基因型香稻的香气及香气合成相关氨基酸和酶进行了比较生理学研究.研究发现:所有参试香稻品种的糙米香气含量均高于对照;香稻品种籽粒游离脯氨酸含量和脯氨酸氧化酶活性以及桂香占和培杂软香籽粒总游离氨基酸含量也高于华粳籼74.通过主成分分析证实,游离脯氨酸、脯氨酸氧化酶和总游离氨基酸是香稻香气合成的主要因子,而鸟氨酸转氨酶与香稻香气的形成无明显关系.

聚乙二醇胁迫对甘蔗伸长期间叶中脯氨酸积累及其代谢关键酶活性的影响

甘蔗品种‘桂糖119’(‘GT119’)、‘新台糖16号’(‘ROC16’)、‘新台糖22号’(‘ROC22’)为材料,在甘蔗伸长期用25%聚乙二醇(PEG)6000淋灌于根部。第4天,‘GT119’与‘ROC16’叶中游离脯氨酸含量明显上升,但‘ROC22’在处理后6d内其含量增加仍不明显。吡咯啉-5-羧酸合成酶活性变化因品种而异,‘ROC22’在处理后第6天才明显上升,其他2个品种则在胁迫处理1d后即明显提高。鸟氨酸转氨酶活性变化不明显。‘ROC22’在处理1d后其脯氨酸脱氢酶活性稍有提高,而其他2个品种则下降。

钝齿棒杆菌N-乙酰鸟氨酸转氨酶的克隆表达分析及其重组菌的精氨酸发酵

N-乙酰鸟氨酸转氨酶(EC 2.6.1.11,ACOAT)是钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum精氨酸合成途径中的第4个酶,催化底物N-乙酰谷氨酸半醛生成产物N-乙酰鸟氨酸。为研究N-乙酰鸟氨酸转氨酶在钝齿棒杆菌中精氨酸合成中的作用,考察其酶学性质,对培养基成分和发酵过程工艺条件的优化提高精氨酸产量提供依据。从精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌SYPA 5-5染色体扩增获得ACOAT编码基因argD,全长1 176 bp,编码390个氨基酸,在Escherichia coli BL21(DE3)及C.crenatum SYPA中成功表达。采用Ni柱亲和层析纯化后获得的重组蛋白比酶活达108.2 U/g,对其部分酶学性质进行初步研究。构建重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA(pJCtac-CcargD),加强精氨酸合成途径ACOAT蛋白表达量,对重组菌产精氨酸进行初步发酵分析。多次发酵结果表明重组钝齿棒杆菌与出发菌株相比胞内ACOAT酶活得以增强;重组菌CCD1精氨酸平均产量为39.7 g/L,产酸提高14.7%。结果还表明在重组菌发酵精氨酸的同时不仅ACOAT得到了加强表达,同时还提高了重组菌在发酵过程中菌体自身的氧利用率。

脯氨酸累积与其合成关键酶活性的关系

假俭草是暖季型的主要成坪草种.5叶期的假俭草幼苗在20%PEG6000(-1.63Mpa)模拟的水分胁迫条件下,脯氨酸作为一种重要的渗透保护物质在24h出现明显增高,而控制脯氨酸合成的谷氨酸途径中的关键酶 1-吡咯啉-5-羧酸合成酶的活性下降,而鸟氨酸途径中的关键酶:δ-鸟氨酸转氨酶的活性却显著增高.S-鸟氨酸转氨酶的活性与脯氨酸的累积有显著的正相关(r=0.96),而 1-吡咯啉-5-羧酸合成酶的活性与脯氨酸的累积呈负相关(r=-0.93).

回旋状脉络膜视网膜萎缩一家系的新型突变与临床观察

目的:探讨一个回旋状脉络膜视网膜萎缩(GA)中国家系各家庭成员OAT基因的致病性突变及临床表现。方法:对该家系中的6名家庭成员均进行详细的眼科检查,通过全外显子组测序、生物信息学分析及Sanger验证明确基因测序结果及致病性突变。结果:先证者因其临床表现及体征诊断为GA。全外显子组测序结果显示先证者OAT基因分别于第6外显子和第10外显子上发现致病突变c.722C>T(p.P241L)、c.1186C>T(p.R396X),该复合杂合性突变在家系中呈现共分离状态。先证者的父亲和哥哥均检出杂合型p.R396X致病变异,母亲检出杂合型p.P241L致病变异。除先证者外,其他家庭成员均无临床症状。结论:该家系的先证者为复合杂合性突变,其中p.P241L为首次报道的基因突变类型。这一研究结果扩大了OAT基因变异的范围,有利于在分子基础水平进一步理解GA的致病因素。新型突变类型的发现与证实也将有助于为GA的临床诊断和基因治疗提供新的依据。

乳果糖灌肠联合门冬氨酸鸟氨酸对肝性脑病患者丙氨酸转氨酶与天冬氨酸转氨酶及血氨水平的影响

目的探讨乳果糖灌肠联合门冬氨酸鸟氨酸对肝性脑病患者丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(ALT)及血氨水平的影响。方法选取2016年7月至2019年7月本月中山大学附属第三医院粤东医院的60例肝性脑病患者作为研究对象,根据随机数字表法分为对照组与观察组,每组30例。对照组行注射用门冬氨酸鸟氨酸治疗,观察组在对照组基础上联合乳果糖灌肠治疗,比较两组临床疗效、ALT、AST、血氨水平以及不良反应发生情况。结果观察组治疗有效率(96.67%)高于对照组(76.67%),差异有统计学意义(P<0.05);治疗2周后,观察组血清ALT为(94.97±25.75)U/L、AST为(102.73±30.36)U/L略低于对照组(98.63±27.34)U/L、(104.98±31.21)U/L,差异无统计学意义(P>0.05);治疗2周后,观察组血氨(59.01±17.32)μmol/L低于对照组(97.41±26.49)μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05);观察组不良反应发生率20.00%(6/30)略高于对照组13.33%(4/30),但差异无统计学意义(P>0.05)。结论应用乳果糖灌肠联合门冬氨酸鸟氨酸治疗肝性脑病可调节血清AST、ALT水平,且可有效降低患者体内血氨水平,疗效显著,且不增加不良反应发生。

门冬氨酸鸟氨酸对隐匿性肝性脑病患者睡眠结构的影响

目的了解隐匿性肝性脑病(CHE)患者睡眠结构的变化以及门冬氨酸鸟氨酸(LOLA)治疗对CHE患者睡眠结构的影响。方法肝硬化伴CHE患者59例随机分为常规治疗组(29例)和LOLA组(30例),以25例不伴有肝性脑病的肝硬化患者为对照组(肝硬化组)。所有CHE患者均进行常规治疗,LOLA组在常规治疗的基础上给予LOLA注射液(10 g·d^(-1),静脉滴注)治疗,共3 d。治疗前后对所有患者进行睡眠结构监测,同时检测血浆氨和血清钠、丙氨酸转氨酶水平。结果 CHE患者的总睡眠时间、微觉醒次数以及N1期、N2期睡眠时间占比均高于肝硬化组,而N3期、R期睡眠时间占比低于肝硬化组,有显著差异(P<0.05)。治疗后,LOLA组患者的总睡眠时间,微觉醒次数以及N1期、N2期睡眠时间占比均低于常规治疗组,而N3期、R期睡眠时间占比高于常规治疗组,有显著差异(P<0.05);同时,LOLA组血氨水平较对照组低(P<0.05)。结论 CHE患者存在睡眠结构的紊乱,LOLA对此有一定的治疗价值。

纳美芬与门冬氨酸鸟氨酸联合治疗肝性脑病的临床疗效

目的观察纳美芬与门冬氨酸鸟氨酸联合治疗肝性脑病的疗效。方法纳入84例肝性脑病患者,随机分为对照组(门冬氨酸鸟氨酸20 g)和联合治疗组(纳美芬0.1 mg和门冬氨酸鸟氨酸10 g),均n=42。观察患者治疗前后的清醒时间、肝功能、血氨等变化。结果对照组和联合治疗组总有效率分别为54.8%和92.9%,两组比较有显著差异(P<0.05)。联合治疗组患者的清醒时间为(6.48±3.69)h,与对照组(27.11±8.21)h相比显著减少(P<0.05)。与对照组相比,联合治疗组患者的丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素和血氨水平均明显降低(P<0.05)。结论纳美芬与门冬氨酸鸟氨酸联用治疗肝性脑病疗效好,优于单用门冬氨酸鸟氨酸。