ω-转氨酶的筛选和异源表达用于制备S-甲氧基异丙胺

根据转氨酶家族进化分类和底物特异性,构建一个包含36个ω-转氨酶的酶库;将酶库中的基因克隆进大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中进行异源重组表达,考察酶蛋白表达水平并测定相应的酶活以及对映体选择性。通过筛选,获得最佳的ω-转氨酶为来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的ω-转氨酶BmeTA,其重组表达粗酶活为2.0 U/mL,纯酶比活为9.5 U/mg蛋白;酶学性质表征发现其最适温度为35℃,最适pH为8.0。在此基础上进一步优化其催化反应工艺条件,在20 g/L加酶量、0.5 mmol/L辅酶添加量以及1.4的氨基供体/氨基受体比例条件下,反应18 h获得450 mmol/L的S-甲氧基异丙胺,原料转化率达到90%,为实现生物催化制备S-甲氧基异丙胺的工业化奠定基础。

甘蔗水分胁迫响应的δ-鸟氨酸转氨酶基因克隆及分子特征分析

通过消减文库技术,结合cDNA芯片技术筛选到1个明显受水分胁迫诱导的EST序列(Ratio值为8.1),比对分析推测其为δ-OAT基因的片段,进而通过RACE结合PCR技术获得该基因全长cDNA序列为1782bp,其中5′端非编码区150bp,开放阅读框为1362bp,3′端非编码区为270bp且存在2个终止加A信号AATAA。预测其编码的蛋白质分子量为49.5ku,等电点为6.5,为一个跨膜蛋白。序列比对分析结果表明,δ-OAT基因家族N末端和C末端相对不保守,而主要功能区均表现保守。基因进化分析显示,单子叶禾本科植物和双子叶植物鸟氨酸转氨酶编码基因分别由各自祖先进化而来,而微生物的鸟氨酸转氨酶编码基因表现出复杂的进化关系。荧光实时PCR分析δ-OAT在根、茎、叶的表达,该基因在茎的表达较高,其次是叶而后为根,但没有明显的组织表达特异性。本文首次报道甘蔗δ-OAT基因克隆研究结果,为该基因的深入研究和应用奠定一定基础。

分子对接技术筛选石菖蒲中γ-氨基丁酸转氨酶抑制成分

目的从石菖蒲药材中筛选抑制γ-氨基丁酸转氨酶(gamma aminobutyric acid-transaminase,GABA-T)的活性成分,拓展虚拟筛选技术在中药药效物质基础研究中的应用。方法从文献中收集石菖蒲药材已知的化学成分群,采用分子对接的方法,筛选石菖蒲药材的化学成分群以辨识GABA-T抑制剂。结果以阳性对照药氨己烯酸的打分函数值为阈值,筛选出化学成分群中9种与GABA-T结合较好的化学成分。结论基于分子对接的虚拟筛选方法可快速筛选石菖蒲药材中GABA-T抑制活性成分,研究结果为石菖蒲抗癫痫药效物质基础研究提供了理论参考。

γ-氨基丁酸转氨酶的动力学特征及其测定法的改良

对γ－氨基丁酸转氨酶（ＧＡＢＡ－Ｔ）的催化反应动力学进行了系统研究。结果显示，ＧＡＢＡ－Ｔ的催化反应属于双底物乒乓机制，最适反应温度和反应时间分别为３０℃和１５ｍｉｎ，ｐＨ值为８．７５，Ｋα－ＫＧｍ和ＫＧＡＢＡｍ分别为２．９７和２．４３ｍｍｏｌ／Ｌ。故底物α－酮戊二酸（α－ＫＧ）、γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）浓度分别为４．８和１８ｍｍｏｌ／Ｌ。此改良法建立了测定大鼠脑组织ＧＡＢＡ－Ｔ活性的微量紫外分光比色法，灵敏度比国外同类方法提高１．９倍。

石菖蒲挥发油纤维素酶辅助提取工艺优化及抑制GABA-T活性成分研究

目的:打开制约中药中GABA-T配体快速筛选方法的瓶颈。方法:建立中空纤维配体垂钓方法筛选石菖蒲挥发油中γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)抑制成分。在响应面法优化石菖蒲挥发油酶辅助提取工艺基础上,将GABA-T溶液注射入中空纤维的管腔中,作为“诱饵”垂钓出石菖蒲挥发油中的潜在活性成分,并验证其GABA-T抑制活性。结果:石菖蒲挥发油的最佳提取工艺为纤维素酶添加量3165 U/g、酶解时间1.8 h、酶解温度45℃,此时石菖蒲挥发油收率可达到2.56%,最终鉴定出51个化合物,主要包括烯烃、醇类、醚类、酮类、酚类、酸类等。将3 mg/mL的GABA-T溶液注射入U型中空纤维管的空腔,共孵育160 min,封口后置于石菖蒲挥发油中进行60 kHz超声垂钓20 min,联合LCMS-IT-TOF系统进行分析,成功筛选出的α-细辛醚对GABA-T活性有浓度依赖性的抑制作用,IC50为57.9μg/mL。结论:建立的中空纤维配体垂钓方法稳定可行、操作简便。

γ-氨基丁酸能系统在脑卒中后痉挛状态中的研究进展

脑卒中后痉挛状态(PSS)是脑卒中后常见的运动功能障碍,目前临床上尚无明确定义,较为常用的定义是Lance教授提出的:包括上运动神经元综合征(UMNS)在内的运动障碍,表现为牵张反射异常兴奋并伴随速度依赖,常导致随意运动减弱或消失和姿势异常等异常肌肉活动[1]。据统计,在所有轻至重度脑卒中患者中,多达42.6%会发展为PSS,而中到重度运动障碍的慢性脑卒中患者中高达97%的患者存在肢体痉挛[2,3]。

以RNA干扰γ-氨基丁酸转氨酶1基因(OsGABA-T1)表达提高稻米γ-氨基丁酸(GABA)含量

γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸,具有降血压等功能。为提高稻米中GABA含量,利用RNA干扰技术,构建水稻中GABA代谢关键酶GABA转氨酶1基因(Os GABA-T1)的干扰载体,通过农杆菌介导法,将其转化至粳稻品种宁粳1号中。实时荧光定量PCR检测结果表明导入的RNA干扰结构成功地降低了目的基因Os GABA-T1的表达,且干扰家系中Os GABA-T2基因表达也随之下降。对转基因T3代稻米GABA含量测定发现,糙米中GABA含量相对于对照增加了13倍以上,精米中GABA含量也显著增加,而其他主要氨基酸含量则没有明显变化。测定储藏4个月的转基因稻米发现,GABA含量仍具有较高水平。所以,利用RNA干扰技术可有效提高稻米γ-氨基丁酸(GABA)含量,为培育富含GABA的降血压功能性水稻品种提供基础。

ω-转氨酶不对称合成手性胺及非天然氨基酸的研究进展

ω-转氨酶不对称合成手性胺及非天然氨基酸是目前生物加工过程的研究热点之一。ω-转氨酶具有优良的立体选择性及区域选择性,利用其进行生物催化生产手性胺,已被应用于医药、农药和化工等领域。本文中,笔者综述了ω-转氨酶的基本结构特性,并以转氨酶法制备西他列汀关键中间体等为例,同时阐述了该酶的高通量筛选方法及分子改造方面的研究进展,并对级联反应提高手性胺产量的策略作了进一步讨论。最后,本文简要总结了ω-转氨酶在不对称合成非天然氨基酸中的具体应用。

青羊参总甙对小鼠脑中谷氨酸脱羧酶和γ-氨基丁酸转氨酶活性的影响

用放射性同位素方法测定了青羊参总甙对小鼠脑中谷氨酸脱羧酶和γ-氨基丁酸转氨酶活性的影响。结果表明,注射青羊参总甙后,正常小鼠脑中谷氨酸脱羧酶、γ-氨基丁酸转氨酶活性无明显变化,但对硫代氨基脲诱发惊厥的小鼠、青羊参总甙可使被硫代氨基脲降低的谷氨酸脱羧酶活性明显恢复,提示青羊参总甙的抗惊厥作用可能与其保护谷氨酸脱羧酶活性有关。

巨大芽孢杆菌ω-转氨酶催化合成手性β-氨基醇

针对目前用于合成手性β-氨基醇的(S)-转氨酶稀缺的问题,对来自巨大芽孢杆菌(Bacillus Megaterium SC6394)的(S)-ω-转氨酶(BMTA)基因密码子进行优化,在大肠杆菌中成功表达,并对BMTA进行纯化表征。结果表明:BMTA对(R)-β-氨基醇具有较高活力,对(S)-β-氨基醇没有活力;BMTA在pH为7.5、温度为55℃下酶活最高,在pH为6.5~8.0,温度为4~30℃内具有较好的稳定性。应用BMTA对不同外消旋β-氨基醇进行动力学拆分,底物转化率高达50%,对映体过量值(ee)为50%~99%。应用BMTA不对称还原胺化不同α-羟基酮,产物(R)-β-氨基醇转化率高达58%~96%,ee>99%。

电针对脑卒中肢体痉挛大鼠γ-氨基丁酸代谢酶的影响

目的:探讨电针通过调控γ-氨基丁酸代谢酶改善脑卒中肢体痉挛大鼠肌张力的作用机制。方法:将24只SD大鼠分为正常组、假手术组、模型组和电针组。用大脑中动脉栓塞法建立局灶性脑缺血模型。电针组造模成功后第3天开始取申脉,照海针刺治疗6天,其余组在同等条件下饲养,不做其他处理。采用Bederson评定神经功能,Ashworth分级评定肌张力,Feeney平衡木评分标准评定运动功能,免疫组化染色SP法、实时定量PCR测定各组标本中GABA-T、SSADH的表达。结果:与模型组相比,治疗后电针组神经功能缺损症状改善(P<0.05);肌张力降低(P<0.05);运动功能提高(P<0.05)。免疫组化染色SP法示GABA-T平均光密度值电针组颈膨大(模型组:0.2256±0.0190;电针组:0.2094±0.0083)和腰膨大中(模型组:0.2163±0.0088;电针组:0.1988±0.0054)较模型组明显下降(P<0.05);而脑干中较模型组表达也有下降趋势(模型组:0.2129±0.0086;电针组:0.2072±0.0119)。实时定量PCR测定SSADHm RNA结果与模型组比较显示电针组脑干(模型组:1.67±0.38;电针组:1.22±0.07)、颈膨大(模型组:1.27±0.28;电针组:0.96±0.09)和腰膨大中(模型组:1.07±0.32;电针组:1.08±0.07)表达均降低(P<0.05)。结论:电针阴阳跷脉腧穴通过降低中枢系统中GABA-T和SSADH的释放使GABA的降解速度减慢,从而增加突触间隙的GABA浓度,增强GABA的抑制作用是改善偏瘫肢体痉挛的可能机制之一。

苏云金芽胞杆菌γ-氨基丁酸代谢途径相关功能基因的克隆、表达及同源性分析

γ-氨基丁酸代谢旁路作为三羧酸循环的一个分支,在真核、原核生物中广泛存在。在这条代谢途径中,涉及γ-氨基丁酸分解代谢的主要有两种酶:一种是γ-氨基丁酸转氨酶,能将γ-氨基丁酸转变成琥珀酸半醛;另一种是琥珀酸半醛脱氢酶,该酶能将琥珀酸半醛氧化形成琥珀酸,后者进入三羧酸循环。从国内分离得到的苏云金芽胞杆菌G03菌株中克隆了gabT和gabD基因。其中gabT基因含有1440bp,编码一个大小为52.6kD的蛋白质,而gabD基因大小为1449bp,编码一个52.2kD的蛋白质。这两个基因都分别在大肠杆菌中进行了表达和纯化。通过酶活测定结果表明,GabT和GabD蛋白分别呈现出γ-氨基丁酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶的活性。氨基酸序列同源性比对分析发现,这两个蛋白质在蜡样芽胞杆菌群(B.cereus group)中具有较高的相似性,而与枯草芽胞杆菌的相似性较低则分别为58%、51%。为进一步深入研究γ-氨基丁酸代谢旁路在苏云金芽胞杆菌中的生物学功能及其转录调控机制奠定了基础。

γ-氨基丁酸代谢酶的研究进展

谷氨酸脱羧酶催化产生的γ-氨基丁酸具有调节血压、促进精神安定和改善脑机能等重要功效。富集高γ-氨基丁酸成为目前研究的热点。该研究对有关γ-氨基丁酸代谢的关键酶的研究概况进行了综述。通过激活或抑制酶活性,促进γ-氨基丁酸的富集,为开发新型保健产品提供参考。

斑茅-δOAT基因克隆及其序列分析

利用RT-PCR和RACE技术从斑茅(Erianthus arundinaceus)中分离出编码鸟氨酸-δ-氨基转氨酶基因的全长cDNA序列,序列全长1 680 bp,编码454个氨基酸。通过对哺乳动物、高等植物、微生物的-δOAT基因编码的氨基酸序列进行同源比对,发现斑茅-δOAT基因同其近缘属植物甘蔗的同源性最高(87%),同其他高等植物的同源性次之(约为70%),而同动物的同源性最低(约为60%)。在斑茅-δOAT基因编码的氨基酸序列的5′端未发现线粒体定位序列,同甘蔗-δOAT基因一样。斑茅-δOAT基因具有完整的鸟氨酸转氨酶功能区rocD。利用定量RCR(real-tim e PCR)对30%PEG胁迫下的斑茅-δOAT基因表达量进行研究,结果表明-δOAT基因在胁迫12 h表达量达到最高,约为对照的4.1倍;胁迫2 h-δOAT基因表达量反而有所降低。

神经元GAD和GABA-T的活性与癫痫发病的关系

目的 研究探索神经元内谷氨酸脱羧酶 ( GAD)和 γ-氨基丁酸转氨酶 ( GABA-T)的活性与癫痫发病的关系。方法 用致痫剂马桑内酯 ( CL)和抗痫剂苯妥因钠 ( PHT)处理大鼠培养海马神经元 ,用液体闪烁计数仪、紫外分光光度计检测培养神经元内 GAD和 GABA-T的活性。结果 与对照组比较 ,CL致痫组培养神经元内GAD活性和 GABA-T的活性显著增高 ;运用抗痫剂 PHT处理致痫神经元后 ,与 CL致痫组比较 ,神经元内GABA-T活性显著降低 ;与对照组比较差异不显著。结论 在癫痫发病中 ,痫性神经元 GAD和 GABA-T活性增高。

羟基马桑毒素及其衍生物对粘虫体内GAD和GABA-T活性的影响

为了探明羟基马桑毒素及其衍生物(T1、T2、T3、T4)对粘虫神经系统的影响以及快速检测对比分析新合成的药物对试虫神经递质γ-氨基丁酸(GABA)相关酶谷氨酸脱羧酶(GAD)和γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)活性的影响,通过胃毒和离体2种处理方式提取粗酶液并采用分光光度法对试虫酶活性进行测定。结果表明,经羟基马桑毒素及其衍生物处理后试虫的GAD酶活受到了抑制,而GABA-T活性被提高,这2种酶影响着试虫体内GABA的含量。离体测定的结果与胃毒处理后试虫体内酶活的变化相似,因此可以采用离体处理方法快速检测新药物对试虫的活性。

牛磺酸、羟脯氨酸、γ－氨基丁酸、鸟氨酸和色氨酸的测定

在日立８３５－５０型氨基酸分析仪上，用７２ｍｉｎ程序进行分析，通常一次只能分析１７种氨基酸。采用本文所述方法则一次能分析２２种氨基酸。在不延长分析时间，不增加成本的情况下，一次多分析了五种氨基酸，提高了仪器工作效率。经过精密度、准确度试验和样品分析证明：该方法测定的数据准确、可靠，是一个又快又省的好方法。

左乙拉西坦治疗儿童癫痫的疗效及其对肝功能、血清MDA和8-OHDG的影响

目的探讨左乙拉西坦(LEV)治疗儿童癫痫的疗效及其对肝功能、血清丙二醛(MDA)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)的影响。方法选取2017年1月—2019年1月在新郑市人民医院儿科接受治疗的160例癫痫患儿为研究对象。采用随机数字表法将患者随机分为观察组(n=80)与对照组(n=80),分别给予LEV和丙戊酸钠(VPA)治疗。比较两组患者治疗前后的肝功能、血清MDA与8-OHDG水平及不良反应发生情况。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清MDA、8-OHDG对患者疗效的评估价值。结果治疗6个月时,观察组治疗总有效率明显高于对照组(χ^(2)=5.331,P<0.05)。观察组治疗前后血清ALT、AST、GGT、MDA、8-OHDG水平比较无显著差异(P>0.05);对照组治疗后血清ALT、AST、GGT水平较治疗前明显升高(t=3.896~4.327,P<0.05),血清MDA、8-OHDG水平较治疗前明显降低(t=8.792、5.014,P<0.05);两组治疗前后血清ALT、AST、GGT、MDA、8-OHDG差值比较差异有显著性(t=4.952~7.258,P<0.05)。ROC曲线结果显示,血清MDA水平预测LEV治疗儿童癫痫有效的AUC为0.857(95%CI=0.755~0.958,P<0.05),诊断的灵敏度和特异度分别为74.2%和78.9%;血清8-OHDG水平预测LEV治疗儿童癫痫有效的AUC为0.823(95%CI=0.706~0.939,P<0.05),诊断的灵敏度和特异度分别为80.6和73.7%。结论LEV治疗儿童癫痫的有效性、安全性优于VPA,LEV能有效降低癫痫患儿血清MDA、8-OHDG水平,且血清MDA、8-OHDG水平对LEV治疗儿童癫痫的疗效有较高的预测价值。

血清白细胞介素-26水平、肝功能相关指标与慢性丙型肝炎患者预后的相关性探讨

目的通过检测慢性丙型肝炎患者血清中白细胞介素-26(IL-26)、C-反应蛋白(CRP)、总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)等水平,探讨血清IL-26、肝功能相关指标与慢性丙型肝炎患者预后的相关性和存在的潜在意义。方法选取本院就诊的慢性丙型肝炎患者140例,其中高病毒载量慢性丙型肝炎患者68例(高病毒组),低病毒载量慢性丙型肝炎患者72例(低病毒组);慢性丙型肝炎患者进展为肝硬化、失代偿肝硬化、肝衰竭或肝癌的55例患者为不良预后组,未发生进展的85例患者非不良预后组。另随机选取同期于本院进行体检的健康人群140例为对照组。采用全自动生化分析仪检测血清AST、ALT及TBIL水平;采用免疫比浊法测定CRP水平;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清IL-26水平;采用Logistic回归分析影响慢性丙型肝炎患者发生不良预后的危险因素。结果高病毒组与低病毒组慢性丙型肝炎患者血清IL-26、CRP、TBIL、ALT、AST水平均显著高于对照组,且高病毒组显著高于低病毒组(P<0.05);不良预后组血清CRP、TBIL、ALT、AST及IL-26水平均显著高于非不良预后组(P<0.05);Logistic回归分析结果显示,血清CRP、ALT、AST及IL-26水平均是影响慢性丙型肝炎患者发生不良预后的独立危险因素(P<0.05)。结论慢性丙型肝炎患者血清IL-26水平升高,且与患者病毒载量正相关;血清CRP、ALT、AST及IL-26均与患者预后存在一定相关性,可能是评估慢性丙型肝炎患者预后的潜在参考指标。