基因重组鸡α-干扰素在肉鸡体内的药代动力学研究

选择40只32日龄健康AA肉鸡按1万IU/0.6ml基因重组鸡α-干扰素0.6ml肌肉注射给药后,不同时间点采血。用基因重组鸡α-干扰素检测试剂盒检测血清中浓度,研究其在血清中的药代动力学。通过3P97药动学软件分析主要药物动力学参数:分布半衰期(T_(1/2α))、消除半衰期(T_(1/2β))、药物清除率(CL)、药时曲线下面积(AUC)等。结果表明,肌肉注射1万单位基因重组鸡α-干扰素后肉鸡吸收迅速,达峰时间短,吸收较完全,能在体内较快的消除。

鸡α干扰素基因的原核表达及其活性测定

应用RT-PCR技术,从被刺激诱导的鸡脾脏淋巴细胞中扩增鸡α-干扰素(ChIFN-α)基因cDNA,经克隆和测序后,构建原核表达重组质粒pGEX-proChIFN-α(全长序列)和pET-ChIFN-α(不含信号肽序列),并分别转化相应的表达菌。重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,ChIFN-α基因均获得表达,重组蛋白大小分别为45ku、26ku左右,表达的蛋白以包涵体形式存在。表达产物经变性、提纯、复性,重组蛋白的含量约为1mg/mL。复性后的ChIFN-α能够在鸡胚成纤维细胞上抑制H5N1禽流感病毒的复制;用水泡性口炎病毒检测结果表明,重组ChIFN-α具有较高的抗病毒作用,其生物学活性达到2×106u/mg。

ASP-ChIFN-α融合基因的构建及表达

利用PCR技术从宁夏地方三黄肉鸡肝组织中扩增出α干扰素基因,构建成原核重组表达质粒pET-28a/ChIFN-α.从埃希氏菌属大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出L-天(门)冬酰胺酶Ⅱ(L-Asparaginase,ASP)信号肽基因,并与原核重组质粒pET-28a/ChIFN-α连接,构建成分泌型表达重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α.将重组质粒经IPTG诱导5 h,用SDS-PAGE分析表达蛋白含量,并用鸡α-干扰素ELISA(Western-blot)试剂盒检测表达的重组蛋白的特异性.结果表明,包涵体型重组质粒pET-28a/ChIFN-α和分泌型重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α在23 kD处均表达出目的蛋白,蛋白含量分别为27%和38%,pET-28a/ASP-ChIFN-α的蛋白表达含量比pET-28a/ChIFN-α的蛋白表达含量要高出11%,表达的重组蛋白具有特异性.实验实现了鸡α-干扰素成熟蛋白基因的高效表达,筛选出了可应用于临床的鸡α-干扰素高效表达菌株BL21(DE3)(pET-28a/ASP-ChIFN-α).

低温胁迫对转ChIFN-α基因百脉根抗寒生理生化的影响

为研究转Ch IFN-α基因百脉根的低温生长特性,对其进行4℃低温离体水培和可溶性蛋白(SP)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和脯氨酸(Pro)的测定分析,探讨低温胁迫对转Ch IFN-α基因百脉根的影响及机制。研究发现,25 d低温处理期间,百脉根植株均生长迟缓,野生型(WT)还出现叶片枯黄和茎基部腐烂等冻害现象。转基因百脉根(TP)植株同期的MDA含量比WT低1.03倍(p<0.01),WT的MDA下降幅度仅为TP植株的86%。TP同期的SP、SOD、Pro含量均较WT高(p<0.01),且出现的降幅小。TP同期的SP、SOD和Pro含量分别是WT的1.21倍、1.27倍和1.72倍(p<0.01),WT同期的SP和SOD降幅分别是TP的2.26倍和1.93倍(p<0.01),TP植株的SOD含量峰值比WT提前5 d,TP的Pro在中后期增至WT植株的150%和129%。结果表明,转基因百脉根具有较好的低温耐受性和耐受生理基础,这对其在高寒山区的进一步应用及管理提供了基础依据。