鸡Ⅰ群禽腺病毒血清4型油乳剂灭活疫苗的研制

为研制鸡Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)油乳剂灭活疫苗,试验采用鸡肝癌细胞(LMH)扩增FAdV-4,测定FAdV-4最佳灭活条件和疫苗最佳油水比,研制了FAdV-4油乳剂灭活苗。按《中华人民共和国兽药典》进行疫苗质量、安全性和临床效力检验。结果显示:LMH细胞接种FAdV-4 72h后其毒力最高,TCID50=10-7.78/0.1mL;终浓度0.15%的甲醛溶液37℃24h可灭活FAdV-4;油水比为2∶1的疫苗性状最稳定,质量和安全性检验均合格;疫苗最小免疫剂量为0.4 mL/只;抗体水平在免疫后第2周开始上升,第4周达到最高,而后缓慢下降。对疫苗免疫鸡14 d后注射0.2 mL FAdV-4病毒液(含10-5.78TCID50/0.1 mL),经14 d观察可见鸡全部存活,剖检后无病理变化且攻毒后第3、5、7、10、14天PCR检测均为阴性,临床保护率为100%。研究提示:LMH细胞可有效提高FAdV-4毒价,通过优化FAdV-4灭活条件和疫苗油水比,所研制的疫苗安全性高,保存期长,能有效预防FAdV-4感染,为鸡心包积液综合征防控提供参考。

表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

禽腺病毒血清4型Hexon蛋白的转录组学功能分析

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)是引起禽肝炎-心包积液综合征的重要病原,严重危害我国养禽业的发展。研究表明,FAdV-4六邻体(Hexon)蛋白是决定病毒毒力和致病性的重要因素之一。为了进一步探究Hexon蛋白在FAdV-4感染中的重要作用,本试验以鸡肝癌细胞(LMH)为研究模型,利用转录组测序技术对外源表达Hexon所诱导的差异表达基因进行筛选。结果显示,与对照组相比,外源表达Hexon试验组共筛选到445个差异基因表达上调,36个差异基因表达下调。其中,BAG3、JUN、IL8L1、CCL4和THBS1等基因之前已被报道与FAdV-4感染相关,但HSPB9、HSP90AA1、HSPA8、HSPA2、DCN、ELOVL3和SBK2等基因在FAdV-4感染中的作用还未被揭示。GO富集分析结果显示,下调的差异基因主要与早期内体和蛋白酶体附属复合体相关,而上调的差异基因主要与质膜、细胞外表面区域和超分子纤维相关。KEGG通路富集分析结果显示,差异表达基因主要富集在MAPK、Wnt和VEGF等信号通路。此外,通过蛋白质相互作用网络分析发现,HSP90AA1、HSPA8、JUN和DCN等多个关键蛋白位于整个网络中心且已被报道与多种病毒复制密切相关。综上所述,本研究通过转录组测序筛选出一系列由外源表达Hexon诱导的差异表达基因,为控制FAdV-4感染提供了新的靶点和理论依据。

Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体中和效价与攻毒保护相关性研究

为了研究Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体中和效价与攻毒保护的相关性,取3批实验室试制抗体,分别通过预防试验和紧急预防试验模型进行抗体中和效价与靶动物攻毒保护力相关性试验。预防试验:21日龄SPF鸡经颈背部皮下注射中和效价分别为1:64、1:128、1:256的蛋黄抗体,每只0.5 mL,168 h后接种Ⅰ群4型禽腺病毒检验用强毒,观察10日。紧急预防试验:先给21日龄SPF鸡接种Ⅰ群4型禽腺病毒检验用强毒,36 h后经颈背部皮下注射不同中和效价的抗体,每只0.5 mL,观察10日。结果表明:当中和效价为1:128时,攻毒保护率均达到80%以上;当中和效价为1:256时,攻毒保护率均达到90%以上。故本研究结果表明,抗体效价不低于1:128时可有效抵御Ⅰ群4型禽腺病毒的攻击。

我国主要流行的4种血清型禽腺病毒-Ⅰ群感染SPF鸡的致病性比较研究

旨在对我国流行的4种血清型(4、8a、8b和11型)禽腺病毒-Ⅰ群(fowl adenovirus,FAdVs)对鸡胚和鸡的致病性进行研究,选取12日龄SPF鸡胚和10日龄SPF鸡感染4种血清型FAdVs,对SPF鸡胚和鸡的死亡率及鸡胚胚体质量进行统计;对感染鸡的大体剖检变化、组织学变化进行观察和病毒载量进行研究。结果显示,FAdV-8b和FAdV-11感染SPF鸡胚后其死亡率高于45%,FAdV-8a感染后胚体质量降低最严重,FAdV-4感染后对胚体质量影响最小;FAdV-4感染SPF鸡死亡率高达53.3%,其他组鸡无死亡;除肝出现肿胀、变性、出血和炎性细胞浸润外,4种病毒感染SPF鸡后分别造成不同组织器官的严重损伤,FAdV-4感染出现心包积液、FAdV-8a感染肌胃出现糜烂、FAdV-8b感染导致腺胃肿胀和FAdV-11感染导致胰腺坏死,各损伤组织均出现实质细胞坏死和炎性细胞浸润;4种病毒感染SPF鸡均出现免疫器官的组织学损伤,其中,FAdV-8a、-8b和-11感染鸡引起的免疫器官内淋巴细胞缺失和损伤较FAdV-4更为严重;组织病毒载量结果显示,FAdV-4感染鸡心和肾病毒载量最高,FAdV-8b和FAdV-11感染鸡胰腺病毒载量高于FAdV-4感染组,且FAdV-4感染鸡心、肝和肾病毒载量在感染后第5天高于第3、7天,除FAdV-8a感染组外,病毒载量与各组织损伤情况相一致。综上表明,4种血清型FAdVs中,FAdV-11对SPF鸡胚的致死性最强,FAdVs对SPF鸡的致死率最高,尽管FAdV-8a、-8b和-11不致死SPF鸡,但对SPF鸡胚、SPF鸡的消化系统和免疫系统损伤较为严重,这将会造成鸡胚孵化率降低、鸡生长发育缓慢和易于继发其他病原感染。

Ⅰ群禽腺病毒血清4型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为储备禽腺病毒病疫情防控技术,应用DNAStar软件分析GenBank中Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)全基因序列,选取Hexon基因的保守区域设计合成1对PCR引物和1条TaqMan探针,建立FAdV-4FQ-PCR检测方法,得到相应的标准曲线,并应用该方法对临床病例和人工感染动物进行FAdV-4核酸检测。结果表明,建立的FAdV-4FQ-PCR方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性和临床应用性。

新城疫-禽流感(H9亚型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗对不同日龄雏鸡的免疫效力研究

为评估新城疫-禽流感(H9亚型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗的免疫效力,采用该疫苗分别免疫7、14、21日龄的SPF雏鸡和商品雏鸡,免疫后21 d采血测定新城疫病毒(NDV)HI、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)HI及禽腺病毒(FAdV)中和抗体,并用禽腺病毒(Ⅰ群,4型)强毒攻击。结果显示:免疫后各不同日龄免疫组SPF雏鸡的NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体效价分别为8.2 log2~8.5 log2、8.8 log2~9.6 log2和9.7 log2~10.3 log2,FAdV攻毒保护率均达到100%(10/10);21日龄SPF鸡免疫后3个月,试验鸡NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体分别达7.2 log2、7.8 log2和11.3 log2,FAdV攻毒保护率均为100%(10/10);不同日龄免疫组普通雏鸡NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体效价分别为6.7 log2~7.6 log2、7.9 log2~8.7 log2和9.8 log2~10.3 log2,FAdV攻毒保护率均达到100%(10/10)。表明该疫苗可对不同日龄SPF雏鸡和商品雏鸡产生良好的免疫力,对雏鸡免疫持续期达3个月。

Ⅰ群4型禽腺病毒DC株在LMH细胞的增殖工艺研究

为探索Ⅰ群4型禽腺病毒DC株在LMH细胞的生长特性和增殖规律,通过研究病毒接种量、收毒时间、接毒时间、温度和维持液血清浓度等病毒增殖条件,筛选、优化了病毒增殖工艺。结果表明病毒最佳的增殖条件为:在37℃条件下培养,最佳接种量为1%,接种时间为细胞传代后生长72 h,维持液血清浓度为2%,维持液中不添加0.25%胰蛋白酶,收获时间为病毒接种后72 h。LMH细胞是Ⅰ群4型禽腺病毒DC株较适合的病毒培养系统,为研制Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗提供了有利工具。

5株Ⅰ群4型禽腺病毒的分离与鉴定

对5份不同来源的临床上疑似禽腺病毒感染鸡组织处理后接种6～7日胚龄SPF鸡胚,经过LMH细胞传代,通过血凝性检测和PCR方法对细胞培养物进行鉴定。血凝性检测表明分离物不能凝集鸡红细胞,对Hexon和52K基因的序列分析显示,分离到5株病毒为Ⅰ群4型禽腺病毒(FAdV-4)。动物回归试验结果表明,5个病毒株均能致40日龄SPF鸡死亡,死亡率达80%以上,并表现与FAdV-4感染临床发病相似的症状。研究结果为探究国内FAdV-4分子流行与毒力演变以及病毒感染的预防提供了基础材料。

Ⅰ群4型禽腺病毒DC株灭活苗对流行毒株的保护力试验

为了检验Ⅰ群4型禽腺病毒(FAdV-4)DC株对几个流行毒株的保护力,使用含有DC株的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病、禽腺病毒病(Ⅰ群4型)(La Sota株+BX13株+BJQ902株+DC株)四联灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫接种后21 d采血测定FAdV-4中和抗体,然后分别用DC株和2015年-2017年分离的5个FAdV-4分离株(ZB2016株、ZD2015株、SC2016株、DT1-2017株和DT2-2017株)进行攻击,观察新流法腺四联苗对FAdV-4流行毒株的保护效果。结果显示,免疫组鸡FAdV-4中和抗体效价达到9.6 log2~10.1 log2,而对照组鸡中和抗体为0;免疫鸡用DC株、ZB2016株、ZD2015株、SC2016株、DT1-2017株和DT2-2017株攻毒后,免疫组鸡得到100%(10/10)保护,对照组鸡90%(9/10)~100%(10/10)发病。试验证明,用含DC株制备出的新流法腺四联苗对腺病毒的流行毒株具有较好的保护效力。

Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体在鸡体内的消长规律

将Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体注射到SPF鸡体内,通过测定不同时间点鸡血清的抗体效价,确定卵黄抗体在体内的消长规律。结果发现,注射后6 h即可在实验鸡体内检测到较高水平的抗体,平均中和效价达到1:82,12 h抗体水平达到高峰,平均中和效价为1:124,然后逐渐降低,到12 d抗体平均效价降至1:13。卵黄抗体注射后3、6、9、12 d,利用Ⅰ群4型禽腺病毒进行攻毒试验,结果显示,抗体注射后6 d(体内平均中和抗体为1:36)能起到完全保护作用,9 d(体内平均中和抗体为1:22)只能产生部分保护作用,12 d(体内平均中和抗体为1:13)完全起不到保护作用。

禽Ⅰ群腺病毒血清1型株灭活疫苗的研制

优化病毒的增殖条件,获得108.14 TCID50/mL,病毒粒子数为108.74 copies/mL的FAV-1抗原液,制备禽I群腺病毒血清1型(FAV-1)油乳剂灭活苗。比较甲醛及β-丙内酯的灭活效果,并进行疫苗成分最佳配比的优化,最后确认HLB 7.0,乳化剂含量10%,油水比为4∶1的比例稳定性最好、免疫效果最佳。疫苗免疫抗体水平的监测结果表明接种后第4周抗体水平达到最高峰,并在接种后第8周时仍具有较高抗体水平。攻毒试验结果显示,该疫苗对免疫组的保护率为100%,能完全抵抗病毒攻击。田间试验表明该疫苗达到预期免疫抗体水平,在接种后4个月保持高效价,到6个月时保持中等水平。本研究所研制疫苗免疫效果好,保存期长,安全性高。

禽腺病毒血清4型感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR分析

旨在分析禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NLRP3。以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。通过反应条件优化,成功建立了检测NLRP3基因的实时荧光定量PCR方法,并利用该方法对致病性FAdV-4感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平进行了分析。结果显示,所设计的NLRP3引物可特异性扩增鸡NLRP3基因,建立的实时荧光定量PCR对鸡NLRP3标准质粒的扩增曲线良好,标准品的拷贝数与Cq值呈现良好的线性关系。与对照组相比,NLRP3分子在FAdV-4感染鸡肝和脾中的转录水平极显著高于对照组(P<0.001),在盲肠扁桃体和法氏囊的表达显著高于对照组(P<0.01)。本研究所建立的鸡NLRP3基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可以检测FAdV-4感染鸡不同组织中NLRP3的转录水平;致病性FAdV-4感染所造成的组织炎症损伤与NLRP3分子密切相关。

血清1型Ⅰ群禽腺病毒Fiber-2蛋白的表达及其中和作用研究

为研究血清1型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-1)的Fiber-2蛋白对FAdV-1在细胞水平上的中和作用,研究根据FAdV-1亚型Fiber-2基因序列设计引物,进行Fiber-2全基因序列PCR扩增并构建重组质粒,转入BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫SPF鸡制备抗血清,通过鸡LMH细胞研究Fiber-2蛋白抗血清对FAdV-1感染的中和作用。结果显示,FAdV-1 Fiber-2基因扩增产物大小为1 233 bp,构建了pCold-FAdV-1-Fiber-2重组质粒,表达的FAdV-1 Fiber-2蛋白分子量大小为105 ku;FAdV-1 Fiber-2蛋白的抗血清孵育LMH细胞后,与阳性对照组相同第4天细胞出现病变,而阴性对照组细胞均无病变。结果表明,FAdV-1 Fiber-2蛋白抗血清在体外试验中不能中和本血清型病毒的感染,FAdV-1 Fiber-2蛋白作为亚单位疫苗的研究存在风险。

Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,参考Gen Bank中已发布的禽腺病毒的六邻体基因(Hexon)序列设计两对引物,通过PCR扩增出Hexon基因的954 bp目的片段,克隆至p MD-19T载体,提取阳性质粒测定浓度,10倍系列稀释作为荧光定量PCR的标准品模板,制备标准曲线。结果显示,荧光定量PCR熔解曲线峰值单一,产蛋下降综合症病毒(EDSV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)等外源病毒均无扩增曲线出现,对标准品模板最低检出值为1.2×101拷贝/μL。对7份Ⅰ群4型禽腺病毒的细胞培养物的检出率为100%,表明建立的实时荧光定量PCR检测方法准确可行。

Ⅰ型禽腺病毒在我国鸡群中的流行情况和防控措施

腺病毒是全世界家禽和野禽常见的传染病原。许多腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，但有一些因素，特别是并发感染时，腺病毒可成为条件性病原。根据血清学关系，禽腺病毒可以分为12个血清型(FAdV1-12)。而国际病毒分类委员会（ICTV）将禽腺病毒的12个血清型分为5个亚群(FAdVA-E)。I群禽腺病毒在中国鸡群中发病率非常之高，且呈逐年上升趋势,且在水禽中也有发病的报道。主要造成鸡群的包涵体肝炎和心包积液两种临床类型，给养鸡企业造成较大的经济损失。笔者通过对流行地区腺病毒的跟踪监测和对病毒的分离鉴定，以了解I型禽腺病毒在我国的流行特点和现状，同时对该病的防控提供一定的措施。

血清4型禽腺病毒山东株基因组序列的克隆及遗传演化分析

从山东某地区发生心包积液综合征的发病鸡中收集病料,按常规方法处理后接种SPF鸡胚,分离到1株病毒,经PCR和测序分析鉴定该分离株为Ⅰ群禽腺病毒、血清4型禽腺病毒,命名为FAV-SD。合成引物成功扩增病毒全基因组序列,并进行序列的测定与分析,结果表明FAVSD株全基因组大小为43752 bp,通过hexon基因同源性比对,FAV-SD与我国今年报道的禽腺病毒血清4型同源性最高;遗传进化分析结果表明,FAV-SD分离株与我国禽腺病毒血清4型流行毒株处于同一分支,而与国外禽腺病毒血清4型毒株不在同一分支,存在遗传差异,说明中国流行的血清4型禽腺病毒具有自身地域特点。该病毒株的分离鉴定为禽腺病毒疫苗的研制奠定了基础。

Ⅰ群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

利用纯化的 Ⅰ 群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了 Ⅰ 群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法.结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/mL;最佳封闭液为1% 牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60 min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60 min;最佳显色时间为10 min.用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测.

山东省血清4型禽腺病毒的分离鉴定

近期从山东省许多地区爆发的以心包积液为主要病变特征的发病鸡中分离到10株病毒,经PCR检测和血清型鉴定,确定为血清4型禽腺病毒。SPF鸡回归试验证实,分离到的病毒能完全复制出与临床自然发病鸡相同的症状与病变。用该病毒制备的灭活疫苗具有良好的免疫保护作用,制作的抗体也具有良好的治疗效果。

我国新发高致病性血清4型禽腺病毒毒力增强的分子机制

Ⅰ群禽腺病毒(FAd V-I)是危害家禽养殖业的重要传染病病原,可分为5个种(A~E)和12个血清型(1~7、 8a~8b、 9~11),主要感染鸡、鸭、鹅等家禽,野鸡、火鸡、鸽、鸵鸟等野鸟也可感染。FAd V-I主要通过呼吸道和消化道传播,不同血清型病毒株发病率和病死率差异较大,致病毒株感染家禽通常表现为包涵体肝炎(IBH)、心包积液-肝炎综合征(HHS)等病变,非致病病毒株感染则无典型临床症状和病理变化。