ER、bcl-2和p53在鸡与鹌鹑属间杂交种早期胚胎中的mRNA表达

通过人工授精获得鸡（♂10只）与鹌鹑（♀100只）属间杂交种蛋并同机入孵，采用Wpkci引物和多重PCR鉴定66～120h的鸡（♂）与鹌鹑（♀）属间杂交种活胚的性别后，选取不同时间点雌、雄胚胎共300枚，以β-actin为内标，通过RT-PCR分别测定雌激素受体（职）和细胞凋亡因子（bcl-2、p53）的mRNA相对丰度；探讨ER、bcl-2和p53对杂交种早期胚胎发育及性别分化的影响。结果表明：（1）杂交种胚胎ERmRNA表达在66～84h期间雌性极显著高于雄性（P〈0．01=，由此推测杂交种的性分化时间大致在胚胎发育的66～84h范围内；（2）bcl-2和p53的mRNA表达在杂交胚胎发育过程中具有明显的时序性，说明bcl-2和p53基因对早期杂交胚的发育具有重要的影响。

鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎bcl-2、P53基因表达的差异及发育性变化

【目的】探讨细胞凋亡因子bcl-2、P53对鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎发育的影响。【方法】人工授精获得鸡(♂)与鹌鹑(♀)杂交种蛋,按照鸡标准孵化条件同批入孵,随机采集66、72、78、84、90、96、102、108、114、120h活胚。采用RT-PCR方法,用Wpkci和β-actin引物进行多重PCR鉴定胚胎样本性别,后选取各时间点雌、雄胚胎各4枚,以β-actin为内标,测定bcl-2、P53的mRNA相对丰度。【结果】(1)雄性胚胎66～114hbcl-2mRNA表达维持在较低水平,96h有所降低,随后回升到原水平,120h极显著升高(P<0.01),达到峰值;雌性胚胎66～114hbcl-2mRNA表达维持在较低水平,114h极显著升高(P<0.01),此后维持在较高水平,120h达到峰值。不同日龄之间的比较,114h雌性表达显著高于雄性(P<0.05);(2)雌、雄胚胎P53mRNA发育性表达模式基本一致。66h表达水平较高,72h表达降低,达到低谷,雄性达到显著(P<0.05),雌性整体差异不显著,随后上升维持在原水平;不同日龄之间表达差异不显著。【结论】114h雌性胚胎bcl-2mRNA表达高峰点与其P53bcl-2表达最低水平相吻合;72h雌、雄胚胎P53mRNA表达与P53bcl-2表达水平一致,处于低谷点;72、114h早期杂交胚胎bcl-2、P53基因表达出现异常。

雌激素受体在鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎中的差异表达及其作用

旨在研究雌激素受体（ER）与鸡-鹌鹑属间杂交早期胚胎发育、性别分化的关系。人工授精获得鸡（♂）-鹌鹑（♀）杂交种蛋，按照鸡的孵化标准同批入孵，连续采集早期活胚（2．75、3．00、3．25、3．50、3．75、4．00、4．25、4．50、4．75、5．00d），采用RT—PCR法，用Wpkci和β-actin引物进行多重PCR，鉴定早期胚胎性别；之后选取各时间点雌、雄胚胎各4枚，以β-actin为内标，测定ER mRNA相对表达丰度。雌、雄胚胎ER mRNA的发育性变化趋势基本一致，2．75～3．00d表达水平均较高；3．25d雄性表达水平显著降低（P〈0．05），雌性则极显著降低（P〈0．01）；3．50d雌、雄表达水平又回复至较高水平；3．75d二者均极显著降低（P〈0．01），此后一直维持在较低水平。不同日龄间比较，2．75～3．50d雌性ER表达高于雄性，差异极显著（P〈0．01）。杂交胚胎性分化时间大致开始于胚胎发育的第2．75～3．50d，性分化期ER的异常表达可能与胚胎死亡、杂种不育有关，这一结论有待于进一步研究发育同期鸡、鹌鹑胚胎ER的表达及其功能后证实。

Wpkci基因用于鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎性别鉴定

【目的】建立鉴定鸡(♂)与鹌鹑(♀)属间杂交早期胚胎性别的方法,检验早期胚胎性别比。【方法】人工授精获得鸡与鹌鹑杂交种蛋,按照鸡的标准孵化条件同批入孵,连续随机采集发育早期66、72、78、84、90、96、102、108、114、120h活胚。采用RT-PCR方法,以已知性别的鹌鹑作外参照,β-actin引物作内参照,用鹌鹑Wpkci基因保守区设计的引物鉴定早期胚胎样本性别。【结果】Wpkci引物可以准确鉴定杂交胚胎的性别;早期胚胎性比率与理论值相比,差异极显著(P<0.01),雄性明显多于雌性;不同天数间性别比率差异不显著(P>0.05)。【结论】利用Wpkci引物建立了一种简单、快速、可靠、稳定的鉴别杂交胚胎性别的方法;早期胚胎雌性死亡率明显高于雄性,雌性死亡率无特定高峰,需进一步研究。

鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎早期死亡可能机制的分析

动物的远缘杂交会产生杂交不育问题,主要表现在胚胎早期死亡、异种生殖细胞不易受精、杂种不育、种间和属间杂交种出现极端不平衡的性别比例。已有学者从组织形态学、生殖生理学、组织化学和染色体遗传学等不同角度进行过研究,多数学者认为远缘杂交染色体及基因结构的变异是导致杂交不育的主要原因。鸡与鹌鹑的杂交是典型的远缘杂交,其不育主要表现在胚胎早期出现大量死亡,在出壳前雌性全部死亡,出壳的全部为雄性但其睾丸不发育而无法正常繁育。本文从胚胎早期死亡的表现、染色体异型配对、胚胎死亡引起的蛋白表达异常、器官分化及相关基因表达异常对胚胎死亡的影响等方面进行了研究与分析。

鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎早期死亡的观察研究

该研究以雄鸡与雌鹌鹑正交组合杂交种的早期胚胎为研究对象,在杂交种蛋入孵不同时间点采取样本,并对所取样本中不同时段杂交种蛋死亡胚胎的形态进行了观察分析。结果显示:除了外在因素外,大约90%以上的死亡胚胎均与杂交种胚胎发育在(72±6)h的形态特征相似;表明属间杂交种早期胚胎大批死亡的确切的时间应为(72±6)h。

鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎性别鉴定体系的建立与优化

研究参考鹌鹑Wpkci和β-actin基因设计引物,采用RT-PCR技术,旨在建立鉴定鸡(♂)与鹌鹑(♀)杂交后代早期胚胎性别的方法。Wpkci引物扩增已知性别鹌鹑及未知性别杂交种胚胎的cDNA,从母禽胚胎获得402bp和296bp两条特异性条带,而公禽没有得到条带。为进一步验证该鉴定体系的可靠性和稳定性,采用了多重PCR从母禽胚胎获得490bp、402bp、296bp三条特异性条带,而公禽只有490bp的内标条带。在对试验关键因素进行优化的基础上,建立了简单、快速、可靠、稳定的鉴定杂交种早期胚胎性别的方法。

鸡与鹌鹑属间杂交遗传效应的分析

通过对鸡、鹌鹑、鸡(♂)与鹌鹑(♀)属间杂交种的42个表型性状值和9种限制性内切酶的mtDNA-RFLP图谱进行分析,探讨了家禽远缘杂交的遗传效应。结果表明:鸡(♂)与鹌鹑(♀)属间杂交种的胸宽、胸深等12个性状具有超亲优势,肌纤维直径等25个性状及mtDNA都遵循母性遗传规律。

鸡与鹌鹑属间杂交受精率的检测及其遗传性分析

以8只安卡红公鸡和120只朝鲜母鹌鹑为研究对象,采用人工授精技术进行鸡(♂)与鹌鹑(♀)的属间杂交,探讨提高鸡与鹌鹑属间杂交受精率的输精方法,分析鸡与鹌鹑属间杂交中亲本母鹌鹑个体间的受精率是否存在差异以及其差异是否存在遗传性。结果显示,鸡与鹌鹑属间杂交的受精率以每天输精两次(9:00和21:00)、每次每只输精量0.020mL和输精深度1cm为最高(49.38%);鸡与鹌鹑属间杂交的杂交母本鹌鹑个体的受精率(0～97.45%)存在较大差异,而这种差异可能并不具有遗传性。

鸡与鹌鹑属间杂交抗精子抗体的检测分析

利用人工授精技术对安卡红公鸡(8只)与单只笼养产蛋高峰期的朝鲜母鹌鹑(107只)进行属间杂交,收集标记母鹌鹑个体杂交种蛋4 024枚(平均每只收集杂交种蛋37.6枚)并同机入孵。经检测,平均受精率为24.85%,最低受精率的个体为0,最高为97.45%,表明属间远缘杂交的受精率低但个体间存在差异。依据个体受精率的高低将所测母鹌鹑分高、中、低3组,对高、低组母鹌鹑血清中抗鸡精子抗体进行对比检测分析,结果发现高受精率组与低受精率组抗精子抗体阳性检测率差异极显著(P<0.01),说明抗精子抗体对鸡与鹌鹑属间杂交的受精率具有重要影响。

鸡与鹌鹑杂交种早期胚胎与性分化相关的ER等基因的表达

本研究旨在对影响鸡与鹌鹑杂交早期胚胎发育及性分化4个基因的表达进行检测,初步判定其对杂交种胚胎性别分化和早期死亡可能起到的作用。研究选取杂交早期胚胎发育不同时间点(72、78、84、90、96、102、108、114、120、144、168和192h)活胚全胚,在鉴定杂交种早期胚胎性别的基础上,采用Real-time PCR方法检测雌雄杂交早期胚胎发育过程中不同时间点性分化相关基因的表达。结果表明,鸡与鹌鹑杂交胚胎中3β-HSD和ER基因雌性的表达量总体显著高于雄性。3β-HSD表达量雄性胚胎在72h最低,雌性和雄性杂交胚胎96h表达量最高。在90h内雌、雄性杂交胚胎P-450c17基因表达水平较高,在78h达到最高峰,在90h内的各个时间点雌性与雄性比较差异极显著(P<0.01)。杂交胚胎P-450arom基因在雌性可以检测到表达,但是雄性不能检测到表达。在杂交胚胎发育早期ER的表达有2个时间点是高峰,分别在72和108h。

鸡、鹌鹑及其杂交种早期胚胎bcl-2基因甲基化的分析

采用甲基化特异性PCR(MSP)方法进行鸡、鹌鹑及其属间杂交种早期胚胎发育期60、66、72、84、96、108、120h7个不同胚龄胚胎组织bcl-2基因启动子区CpG岛甲基化状态的对比分析,探讨bcl-2基因甲基化对鸡与鹌鹑属间杂交种早期胚胎发育的影响。结果显示,正常发育的鸡胚和鹌鹑胚龄在60、66、72、120h均呈高甲基化状态,84和96h呈非甲基化状态,而鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎在60、66、72、96、108和120h则与鸡、鹌鹑不同,呈现出甲基化或非甲基化无规律性并存,甚至检测不到甲基化状态;84h则只检测到非甲基化状态。鸡与鹌鹑杂交种早期胚胎组织中bcl-2基因启动子区CpG岛的异常甲基化有可能是引起鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎早期死亡的一个重要影响因素。

鸡与鹌鹑杂交种早期胚胎发育特异表达基因的初步筛选

利用mRNA差异显示技术，对入孵67～91h的鸡（♀）与鹌鹑（♂）杂交种胚胎中mRNA差异表达进行比较，筛选出与杂交种胚胎早期发育相关的特异表达基因，并克隆测序这些序列，分析这些基因在杂交受精蛋早期胚胎发育中的作用，及其对杂交种早期胚胎死亡是否有影响。分析结果表明，已经获得6个杂交种孵化不同时期的基因片段与鸡的mRNA序列具有高度同源性。其中，孵化第72h时胚胎mRNA表达的序列与鸡雌激素受体结合位点相关抗原mRNA具有高度同源性，孵化第79h时产生的差异片段经过比对，发现：与鸡（♀）肽酰-脯氨酰异构酶类似的mRNA序列具有高度同源性。而杂交种胚胎发育到第72h时，可检测到鸡雌激素受体结合位点相关抗原mRNA的表达，比前人所得到的表达时间（胚胎发育在第84h时检测到）提前了12h，这很可能是造成杂交种早期胚胎大量死亡的原因之一。

Solexa测序技术分析鸡与鹌鹑属间杂交雌性和雄性胚胎的差异microRNAs

分别从孵化3d的已鉴定性别的鸡与鹌鹑属间杂交早期雌性和雄性胚胎组织中提取小RNA,并构建各自的cDNA文库,通过Illumina/Solexa二代测序平台对两样本Small RNA进行高通量深度测序,结合生物信息学的方法对其属间杂交早期的雌性和雄性胚胎中已知的和预测的miRNAs的类型、长度、丰度以及参与的KEGG通路等进行了初步的统计和分析。结果显示,鸡与鹌鹑属间杂交早期雌性胚胎组织的比对序列有16 058 009条,雄性组织有17 943 294条;雌性胚胎预测得到132种miRNA,雄性胚胎预测得到460种miRNA;雌性和雄性样本间差异显著的miRNA有117个(P<0.01);KEGG通路分析表明,这些差异miRNAs的靶基因主要参与了Wnt信号通路、MAPK信号通路、TGF-beta信号通路等与胚胎生长发育相关的途径。结果表明,就已知的miRNAs而言,在鸡与鹌鹑属间杂交雌性和雄性胚胎间存在着一定的差异,这些差异的miRNAs将为后续的功能和调控机理实验研究提供依据。

利用DGE筛选早期雌性鸡与鹌鹑属间杂交种性分化相关基因

已有研究表明鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎早期死亡与性别分化存在关联性,本试验通过高通量测序构建数字基因表达谱(DGE)筛选雌性鸡与鹌鹑杂交种早期(3d)性别分化的相关基因,有助于揭示胚胎性腺分化时期相关基因与其早期死亡间的作用,利用实时荧光定量PCR技术对筛选出与相关表达差异基因进行验证。结果表明,构建雌雄鸡、雌雄杂交种3d胚胎DGE文库,雌鸡与雄鸡之间差异表达基因中有25个上调,41个下调;雌杂交种与雌鸡之间差异表达基因中有55个上调,175个下调;雌杂交禽和雄杂交禽之间差异表达基因中有36个上调,36个下调;这些差异基因大都与胚胎生长发育、细胞分化繁殖相关基因为代表。GO功能富集分析表明,差异表达基因主要定位在参与细胞增殖、分化、胚胎发育等行使催化、促进生物学过程的功能;Pathway分析得出,雌雄鸡、雌鸡与雌杂交种、雌雄杂交种的差异基因分别富集在12、13、15条pathway中。分析推测得出可能由于这些差异基因在体内紊乱表达,导致调控胚胎发育、分化相关信号通路异常是雌杂交种早期死亡原因之一,筛选出的差异基因将为后续的雌性杂交种早期发育、死亡研究提供依据。

用异源蛋白和蛋壳体外培养鹌鹑胚胎的研究

将50个鹌鹑胚胎在鸡蛋壳中用鸡稀蛋白培养,对种蛋产出体外阶段裸黄状态的鹌鹑胚胎进行培养的方法进行了探讨。1～2.5d、2.5～14d和15～17d胚胎培养温度分别是38.0℃、37.8℃和37.5℃,相对湿度分别是60%、55%和70%,1～14d每小时翻蛋1次,翻蛋角度1～2.5d为90°,2.5～14d为50°,15d后静止落盘。2.5d和15d胚胎存活率以及孵化率分别为92%、78%和28%。结果表明裸黄状态的鹌鹑胚胎不排斥鸡稀蛋白,用鸡稀蛋白培养鹌鹑胚胎可行。

科技信息两则

1、美国圣迭戈神经科学研究所埃文·巴拉班,将鹌鹑胚胎中的脑细胞取出,然后移植入鸡胚胎中并进行正常孵化,共培育出40只鹌鹑鸡。其外表与普通鸡无异,只是叫声和举动像鹌鹑。