抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗同居感染试验

疫苗的接触传播是疫苗免疫接种需要考虑的重要因素,为了检测重组鸡痘病毒载体疫苗水平传播的能力,对隔离条件下饲养的SPF鸡用重组鸡痘病毒基因工程疫苗接种,同时设立非免疫对照鸡,饲养期间特意延长清粪时间以增加感染的机会,1个月之后攻击传染性喉气管炎WG株强毒和鸡痘102株强毒,疫苗免疫鸡全部获得保护,而非免疫鸡则全部发病。在试验动物饲养场的自然条件下,将免疫鸡和试验对照两组鸡饲养在同一个鸡舍内,让疫苗毒的传播更接近自然条件。在每个月的攻毒试验中,对照鸡都没有获得对鸡痘和传染性喉气管炎强毒的保护。在疫苗免疫期间进行连续5个月的跟踪检测,同居未免疫鸡没有检测到抗传染性喉气管炎病毒gB抗体。这些实验结果表明抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗不能通过接触传播。

1日龄雏鸡免疫鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗安全性及效力的研究

将鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗以皮下注射和皮下刺种2种不同免疫途径免疫1日龄雏鸡,评价其安全性和效力。以10羽份/只剂量接种后,两组鸡均未观察到全身反应。以1羽份/只剂量接种后28d攻毒,两种免疫方式均可以使免疫鸡产生较强免疫力,能够抵抗传染性喉气管炎病毒(ILTV)WG株强毒和鸡痘病毒(FPV)102株的攻击。以上结果显示,鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗以皮下注射和皮下刺种2种不同途径免疫1日龄雏鸡,具有良好的安全性和有效性。

鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗冻干工艺探索

为筛选出理想的鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗的冻干工艺,保证疫苗产品质量及免疫效果,更好地服务于畜牧业。本试验从冻干保护剂配方与冻干曲线入手,将含有0.8%、1.0%、1.2%、1.5%的明胶5%蔗糖保护剂分别与表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV_ILTVgB)抗原按规定配比,分别在21、24.5、28 h的冻干曲线下完成冻干,并对冻干后的制品检测其效价、真空度、剩余水分及物理性状。结果表明,有1.0%明胶5%蔗糖保护剂24.5 h或28 h冻干曲线和1.2%明胶5%蔗糖保护剂28 h的冻干曲线三种冻干工艺,其制品效价、真空度、剩余水分、物理性状均符合标准。因而采用1.0%明胶5%蔗糖的保护剂配方及24.5 h的冻干曲线是该制品较为理想的冻干工艺。

鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗

鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗是由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所与哈尔滨维科生物技术公司经过多年的课题攻关，研制而成的世界上第一个传染性喉气管炎的活载体疫苗，该疫苗目前已经获得农业部颁发的新兽药(二类)证书(农业部公告第461号)，是世界上第一个达到国际疫苗应用标准，并且完全拥有自主知识产权的禽痘病毒活载体疫苗。

抗传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗

前言 1925年鸡传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis,ILT)首次发生于美国洛岛,是鸡的一种病毒性呼吸道传染病,该病可引起鸡死亡和产蛋下降,目前在多数国家仍有流行,对养禽业造成了严重的危害.疫苗接种是防制本病的一条切实可行的措施.目前,国内外用于预防ILT的都是中强毒力的活疫苗,这些疫苗毒力普遍偏强,接种后反应大.这些疫苗与强毒株一样也能导致持续感染,在鸡体间传播可使毒力返强,使免疫鸡群有可能成为潜在的传染源.而且疫苗免疫后没有一个有效的诊断方法以区别免疫鸡和自然感染鸡,因此,这些疫苗只能限于在传染性喉气管炎流行地区使用.

鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗

本课题的研究起始于1996年，得到“九五”国家高技术研究发展计划（863计划）课题（课题名称：鸡传染性喉气管炎、马立克氏病和新城疫二价、三价基因工程疫苗的研究）的支持（1996～2000年）。后来，该成果又得到了“十五”国家863计划课题（课题名称：鸡痘病毒载体多价基因工程疫苗及禽流感等亚单位疫苗的研制）的支持（2001～2005年）和农业科技成果转化资金项目课题（课题名称：传染性喉气管炎重组鸡痘病毒二价疫苗）（2001年～2003年）的资助。

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的安全性试验与最小免疫剂量测定

将表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV_ILTVgB)通过鸡胚成纤维细胞培养 ,加入适当的保护剂制成冻干疫苗。取 3批冻干疫苗 ,生理盐水稀释后分别经翅内侧无血管处皮下接种 14日龄和 5 0日龄SPF鸡 ,接种剂量为 5× 10 6 PFU ,接种后 3天出现局部反应 ,5天局部肿胀达到最大 ,接种鸡无其它全身反应 ,精神、食欲以及发育等均不受影响 ,说明重组病毒对试验鸡是安全的。取其中的 2 0 0 0 0 3批疫苗 ,用生理盐水作 2 10 -2 ～ 2 10 -5稀释后 ,翅内侧无血管处皮下接种 4 0日龄SPF鸡 ,免疫后 4周分别攻击传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒 10 2株 ,结果表明 ,重组病毒对试验鸡翅内侧皮下接种能产生良好的免疫力 ,在接种剂量为 2 10 -2 ～ 2 10 -40 .1ml/鸡的范围内可以使全部试验鸡产生局部反应 ,当接种剂量为 2 10 -50 .2ml/鸡时可以使部分试验鸡 ( 5 /15 )产生局部反应 ,鸡体对重组疫苗的最小反应剂量为 2 10 -40 .1ml(相当于 10 0 0PFU)。攻毒试验结果进一步证明 ,当接种剂量为 2 10 -40 .1ml(相当于 10 0 0PFU)时可以使免疫鸡产生可靠免疫力 ,抵抗传染性喉气管炎病毒WG株强毒和鸡痘病毒 10 2株的攻击 ,降低鸡群的发病率和病死率。这些结果说明 。

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性评价

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因重组鸡痘病毒 (rFPV -ILTVgB)的稳定性 ,我们对重组病毒进行 6代和 16代克隆纯化 ,对纯化后的病毒通过转瓶连续培养传 2 0代。结果发现第 6代纯化病毒 (rFPV -ILTVgB -C6)在传代过程中有白斑出现 ,说明病毒纯度不够 ;经过 16代纯化的病毒 (rFPV -ILTVgB -C16)对细胞的嗜性加强 ,病毒的效价进一步升高 ,2 0代传代后蓝斑率仍然为 10 0 % ,PCR的检测进一步证明插入的外源基因能在病毒的长期传代过程中稳定地遗传。抽取病毒细胞传代过程中的第 5 ,10 ,15 ,2 0代次的病毒翅膀内侧无血管处皮下接种 2周龄SPF鸡 ,2 0天后分为两组 ,分别用传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒 10 2株攻击 ,结果不同代次的重组病毒均可以使免疫鸡抵抗传染性喉气管炎病毒和鸡痘病毒强毒的攻击。鸡体内病毒传代试验表明 ,重组病毒在接种部位仅存在 6天 ,之后就检测不到病毒 ,重组病毒通过SPF鸡连续传代 ,不存在病毒返祖的可能。由此可以得出一个结论 ,rFPV -ILTVgB在结构上和免疫原性上是稳定的 ,无论是在体外传代 ,还是在体内均可以稳定遗传 ,不存在因为接种重组疫苗而给免疫鸡群带来安全威胁的可能 ,完全可以作为疫苗毒株进行商品化开发。

表达鸡新城疫病毒F、HN基因和传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒的构建及其特性研究

利用同源重组将新城疫病毒(NDV)的F和HN基因、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因以及报告基因LacZ插入鸡痘病毒(FPV)的017株的复制非必需区,其中NDV的F、HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ是在早晚期启动子LP2EP2的控制下,大肠杆菌报告基因LacZ在晚期启动子P11的控制下。经过10轮蓝斑纯化获得了包含了NDV的F和HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ的重组鸡痘病毒,称为rFPV-F/HN/gB/LacZ。经PCR方法证明rFPV-F/HN/gB/LacZ基因组中含有NDV的F基因、HN基因和ILTVgB基因;间接免疫荧光试验和Western-blot试验表明NDV的F、HN蛋白和ILTVgB蛋白在rFPV-F/HN/gB/LacZ感染的CEF细胞中获得表达。与亲本毒相比,重组病毒在病毒的复制和致鸡胚成纤维细胞的病变方面无显著不同。这证明了在鸡痘病毒载体的一个复制非必需区可以同时插入多个禽类病原的多个外源基因,为制备多价基因工程疫苗奠定了基础。

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与免疫试验

本研究构建了编码ILTV主要抗原gB基因的重组DNA疫苗pcDNA-gB,质粒转染293-T细胞的间接免疫表明其表达的蛋白具有免疫反应性。为测定该DNA疫苗的免疫效果,将其与本室保存的重组鸡痘病毒rFPV-gB-gD-IgY分别以单独和混合的方式给4周龄非免疫鸡进行免疫,然后测定ILTV特异性抗体和T淋巴细胞增殖反应。结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答。其中以pcDNA-gB/rFPV-gB-gD-IgY联合免疫组的效果最好,其诱导的抗体水平已接近于常规弱毒疫苗,而细胞免疫水平则比后者高得多。上述研究结果为ILTV新型疫苗的研究奠定了基础。

抗禽流感或传染性喉气管炎两种重组鸡痘病毒疫苗联合免疫的相互影响

"表达H5N1禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒(rFPV-AI)疫苗"以及"表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-ILT)疫苗"均已在实现商业化生产。由于两种疫苗使用了相同的载体病毒,如何使用才能减少相互干扰而产生最好的免疫效果。本研究设计了三个试验组:1)免疫rFPV-AI后间隔4周接种rFPV-ILT;2)rFPV-AI和rFPV-ILT混合后接种;3)将rFPV-AI和rFPV-ILT分别在两个翅膀同时免疫。结果表明,试验鸡接种rFPV-AI后4周接种rFPV-ILT,对传染性喉气管炎病毒WG株攻击的保护率为60%(6/10),低于rFPV-ILT单独免疫组的保护率(100%,10/10);rFPV-AI和rFPV-ILT混合后免疫组对禽流感病毒强毒攻击的保护率为80%(8/10),对传染性喉气管炎病毒强毒攻击的保护率为70%(7/10),而rFPV-AI和rFPV-ILT分两点同时接种对两种病毒攻击均能产生完全保护。本试验结果建议将这两种相同载体的重组病毒疫苗分两点同时接种以避免相互之间的干扰。

鸡传染性喉气管炎重组鸡痘基因工程疫苗免疫效果试验

用鸡传染性喉气管炎重组鸡痘基因工程疫苗、英特威鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗分别免疫鸡群后,观察接种反应并做免疫保护力试验。结果表明,鸡传染性喉气管炎重组鸡痘基因工程疫苗几乎没有接种反应,基因工程疫苗与英特威疫苗对ILT免疫保护率是相同的。一般鸡群通过两次的疫苗免疫接种5个月后,对ILT的免疫保护率能够达到100%。通过对鸡传染性喉气管炎重组鸡痘基因工程疫苗田间试验和区域试验结果表明,用该疫苗免疫鸡群,不仅接种反应小、安全、能有效地防止ILT的发生,而且由于鸡群几乎没有接种反应,育成期死淘率低,鸡群生长发育整齐,在产蛋期能表现优良的生产性能。

鸡传染性喉气管炎病毒病原学和基因工程疫苗的研究进展

本文综述了鸡传染性喉气管炎病毒的病原学特点,并介绍了鸡传染性喉气管炎病毒分子生物学及基因工程疫苗方面的进展情况。

表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体的构建

根据文献设计2对引物,PCR扩增FPV复制非必需区中外源基因插入位点两侧翼的片段,分别克隆到pUC19和pSK质粒中,并命名为pFP1和pFP2。根据文献设计引物,PCR扩增鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因的编码区。将GB基因克隆到质粒pFP1中获得重组质粒pFP1-GB;用酶切质粒pEGFP,得到GFP片段并克隆到质粒pFP2中,得到重组质粒pFP2-GFP。双酶切pFP1-GB得到FP1-GB片段,并克隆到质粒pFP2-GFP中,得到重组质粒pFP1GB-FP2GPF。酶切质粒pE/L-7.5,获得背向连接的2个鸡痘病毒启动子片段——PE/L-7.5,并将该片段克隆到重组质粒pFP1GB-FP2GPF获得重组质粒pGB-GFP,该质粒即为鸡痘病毒的转移质粒。在质粒pGB-GFP中,2个背向连接的启动子被克隆到的GB和GFP基因之间,分别启动GB和GFP基因的表达。经酶切和测序鉴定pGB-GFP,启动子PE/L和P7.5已分别正确地插入到GB和GFP基因之间,分别启动外源表达基因GB和筛选标记基因GFP的表达,从而证明已获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体pGB-GFP。该载体为下一步获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因的重组鸡痘病毒奠定基础。

表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒rFPV-ILTVgB的理化特性及遗传稳定性研究

为检测各理化因子对表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因的重组鸡痘病毒rFPV-ILTVgB的影响,并探究其在体内体外的遗传稳定性,本研究将rFPV-ILTVgB经热、酸、碱、氯仿、乙醚和胰酶分别处理后,接种于鸡胚成纤维细胞(CEF)中,测定病毒的半数感染量(TCID50),结果显示:rFPV-ILTVgB经55℃水浴30 min或60℃水浴15 min可被完全灭活;经pH3~pH9的酸碱作用或经24 h的乙醚作用,病毒滴度变化不明显;经胰蛋白酶或氯仿处理后,病毒滴度下降明显;将rFPV-ILTVgB在CEF中连续培养30代,取第0、5、10、15、20、25、30代rFPV-ILTVgB分别扩增g B基因并测序,通过间接免疫荧光试验鉴定gB蛋白的表达,结果显示:rFPV-ILTVgB能在CEF细胞中稳定传代,gB基因序列在传代过程中未发生任何突变,gB蛋白稳定表达;同时将rFPV-ILTVgB在SPF鸡体内连续传代,结果显示,rFPV-ILTVgB在SPF鸡体内的传代过程中,gB基因的阳性检出率逐渐降低,对鸡体的致病性逐渐降低,不存在毒力返强的可能,符合生物制品的相关要求。本研究选取表达ILTV优势流行株gB基因的rFPV-ILTVgB,首次从分子生物学和遗传学等角度研究该疫苗候选株,为后续该疫苗的生产、运输提供参考。

鸡传染性喉气管炎基因工程疫苗研究进展

鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotrae-theitis， ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotraetheitis virus，ILTV）引起的一种急性呼吸道传染病，其特征性病变是呼吸困难、气喘、咳出血样渗出物，喉部和气管粘膜肿胀，严重者会导致糜烂和出血^[1]。该病呈急性暴发和长期潜伏特性，发病率接近100％，

鸡传染性喉气管炎基因工程疫苗的研究与应用

论述了鸡传染性喉气管炎亚单位疫苗、基因缺失疫苗、重组病毒活载体疫苗、基因疫苗的研究和应用进展情况,表明应用基因工程疫苗免疫可以从根本上改变鸡传染性喉气管炎的防治现状,使传染性喉气管炎的根除成为可能。

鸡传染性喉气管炎疫苗研究进展

鸡传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis,ILT)是由喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV)引起的鸡的一种病毒性呼吸道传染病。ILT是一种较为严重的禽病毒病;根据ILT的临床表现分为急性型和温和型,急性型发病率和死亡率均较高,温和型死亡率低但在养殖密集地区感染逐渐增多。ILT可引起家禽死亡和蛋鸡产蛋率下降,给养禽业带来严重的经济损失。目前,通过使用疫苗接种和生物安全相结合的综合防控措施,在集约化养禽地区ILT已得到较好的控制。该文对多个国家已商品化的ILT减毒活疫苗和重组病毒载体活疫苗,以及正在研发中的ILT重组病毒载体活疫苗、基因缺失活疫苗、病毒样颗粒疫苗等新型ILT疫苗进行综述,以期为更好地防控ILT提供理论参考。

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其原核表达

根据鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因序列和表达载体pBV221的多克隆位点,设计了1对引物。以ILTV疫苗株基因组为模板,应用PCR扩增出gB基因片段,然后将其定向克隆于原核表达载体pBV221中,构建了重组质粒pBV-gB。重组质粒转化到受体菌DH5α中,得到阳性重组菌株DH5α(pBV-gB)。该菌株在温控诱导下,SDS-PAGE电泳可见表达的特异蛋白。ELISA检测证明,表达的蛋白具有较好的反应原性。