鸡传染性支气管炎病毒M41及疫苗株H52,H120 S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列,设计了一对引物并以RT PCR特异性扩增出IBV标准强毒株M41和疫苗株H52,H120的S1基因,基因产物大小为1.62kb,与预期相符.对其测定序列后,同源性比较显示M41株与H52,H120的核苷酸序列的同源性分别为99.2%和97.1%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.3%和95.4%.该结果表明IBVM41与疫苗株H52,H120在S1基因上具有高度的同源性.

复方板蓝根制剂对传染性支气管炎病毒M41株鸡胚感染的疗效试验

为了提高鸡传染性支气管炎病的治疗效果，试验用中药制剂复方板蓝根进行鸡胚感染试验，结果显示，此制剂对胚胎的发育无任何不良影响，且不同浓度的药液对感染鸡胚均有保护作用。因此，复方板蓝根制剂具有明显抗传染性支气管炎病毒的作用。

表面展示鸡传染性支气管炎病毒M41株S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

以鸡传染性支气管炎病毒M41毒株基因序列为模板,利用PCR方法扩增膜定位信号缺失的S1基因(dS1),将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将S1及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBacTMDual,得到重组质粒pFastBac-gp64-dS1.将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组穿梭载体Bacmid-gp64-dS1,提取重组Bacmid质粒,以PCR验证其正确性.将阳性重组Bacmid质粒利用脂质体转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-dS1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以Sf9昆虫细胞膜表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白.

鸡传染性支气管炎病毒M41株鸡胚增殖工艺研究

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41标准毒株在鸡胚上的最佳生产工艺,试验用IBV M41株分别以不同剂量接种同一胚龄不同鸡胚、不同胚龄普通鸡胚,以及IBV M41株接种普通鸡胚后不同培养时间收获鸡胚尿囊液,比较不同培养条件下制备病毒液的产量及病毒效价。结果显示:IBV M41株接种无传染性支气管炎病毒母源抗体的SPF鸡胚最佳病毒接种剂量为104.5EID50,接种含有IBV母源抗体的普通鸡胚最佳病毒接种剂量为105.1EID50,最佳接种胚龄为11日胚龄,最佳收毒时间为48 h。按照此工艺制备疫苗,免疫SPF鸡,IBV抗体效价均符合规程标准。研究结果为用鸡胚高效、大量生产IBV M41株病毒抗原进而生产合格的IB疫苗提供了数据支持。

鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种保存期试验

对保存于中国兽医微生物菌种保藏管理中心的4个不同年代(1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月)冻干的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株毒种进行了对雏鸡的毒力和病毒含量测定试验,结果表明:4个不同保存年代的IBV M41株毒种均能使雏鸡100%出现鸡传染性支气管炎典型症状,病毒含量均≥10^(6.0)EID_(50)/0.1 mL。其中一支毒种在-70℃以下保存22年11个月,其毒力和病毒含量均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○年版)规定,能够满足检验需求。本试验为探寻IBV M41株毒种更加合理的保存期提供了参考。

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株M基因的分子特征

本实验根据已经发表的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)M蛋白基因序列设计并合成一对引物 ,利用RT_PCR扩增得到了IBV新疆分离株LX4株 (HA价为 2 7)M基因 678bp的片段 ,将该片段克隆到PUC18载体上 ,通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒。采用Sanger’s双脱氧末端终止法对插入片段进行核苷酸序列测定 ,获得了IBV_LX4株M基因的核苷酸序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将它与GENBANK中发表的 15株国外参考毒株相比较 ,发现核苷酸的同源性 (除D14 66和DE0 72外 )为 85 % ～92 % ,氨基酸的同源性为 83 % ～92 % ,与国内参考株 (H5 2_GD)相比分别为 90 %和 92 % ,确证我们得到的克隆片段为IBV -LX4株的M基因。且含有两个糖基化位点 ,9个高度保守的半胱氨酸 ,三个跨膜区域 。

鸡传染性支气管炎病毒国内分离株D971 mRNA_3和mRNA_4 cDNA的分子特征

参照已发表的鸡传染性支气管炎病毒 (infectious bronchitis virus,IBV)基因序列 ,设计合成了 1对引物 ,经 RT-PCR扩增得到了 IBV国内分离株 D971约 1.3kb的片段 ,其中包含 3a、3b、E及 M蛋白基因的完整 ORF,并将该片段进行了克隆和序列测定。与国内外部分 IBV毒株序列比较表明 :D9713a基因与 CU- T2、D14 6 6、DE0 72、M4 1、GA/99和 UK/6 6的 3a基因核苷酸序列同源性在 83%～ 89%之间 ,氨基酸序列同源性为 77%～ 91% ,其中与 CU- T2毒株的同源性最低 (分别为 83%和 77% ) ;3b基因与上述毒株的对应核苷酸序列同源性在 85 %～ 95 %之间 ,氨基酸序列同源性为 72 %～ 96 % ,与 CU- T2的同源性最高 (分别为 95 %和 96 % ) ;E蛋白基因与 CU- T2、D14 6 6、DE0 72、M4 1、Ark99、H5 2、Gray、GA/99和 UK/6 6的核苷酸序列同源性在 81%～ 86 %之间 ,氨基酸序列同源性为 74 %～ 80 %。不同毒株推导的 E蛋白 C末端表现不同特征 ,其中 D971E蛋白 C末端比 CU- T2的对应区多 9个氨基酸残基 ,而比本试验选用的其他参考毒株的相应区域短 5～ 7个氨基酸残基。M基因与 CU - T2、DE0 72、Gray、M4 1、H12 0、H5 2、SD/97/0 2、L X4及D4 1的 M基因核苷酸序列同源性在 86 %～ 91%之间 ,氨基酸序列同源性为 85 %～ 95 % ,其?

鸡传染性支气管炎病毒地方分离株S1、N和M基因的克隆与表达

为研究鸡传染性支气管炎病毒DNA疫苗,构建了表达IBVS1、M和N基因真核表达载体,并且BHK-21细胞和小鼠体内进行了表达检测,将IBVSX16株的S1、N和M基因克隆入真核表达载体pVAX1,构建IBV真核表达载体pVAX1-16S1、pVAX1-16N和pVAX1-16M。体外转染BHK-21细胞,用间接ELISA检测到目的蛋白表达,用构建的3个表达载体免疫小鼠,从小鼠血清中检测到了抗IBV抗体,初步证实用IBVS1、N和M基因作为核酸疫苗免疫动物,可以激活机体免疫应答。

鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株M蛋白基因的变异及其B细胞表位稳定性

以陕西8株鸡传染性支气管炎病毒（AIBV）分离株M蛋白的基因序列为基础，应用DNAStar软件中的MegAlign模块对其进行了同源性分析；用Kyte-Doolittle方法、Jameson—Wolf方法、Karplus—Schulz方法、Plot—Emini方法和Garnier-Robson方法综合预测了其中4株代表毒株的M蛋白B细胞抗原表位和二级结构。结果，8株AIBV的M蛋白主要在10～40aa和90～175aa处存在无规律的点突变，与参考毒株H52、M41、SAIB20、LX和Gray的M蛋白的核苷酸序列和预测的氨基酸序列的同源性分别介于87．4％～99．5％和96．3％～99．5％；分离株间的核苷酸序列和预测的氨基酸序列同源性分别介于91．8％～99．8％和95．4％～100％。4株代表株的M蛋白B细胞优势抗原表位都在159～164aa和181～193aa肽段区（这2个区域都包含了无规则卷曲和β-转角结构）或其附近。结果表明，AIBV分离株的M蛋白基因相对保守，只存在无规律的点突变，该变异对AIBVM蛋白B细胞表位的稳定性无影响。

传染性支气管炎病毒M_(41)株种子批的建立

[目的]为生产鸡传染性支气管炎疫苗奠定基础。[方法]在研究制备鸡传染性支气管炎疫苗所用毒种的毒力、免疫原性、保存期等的基础上,测定4种来源的传染性支气管炎病毒M41株的50%鸡胚感染量(EID50),选取滴度较高病毒作为毒种,建立传染性支气管炎病毒M41株种子批,并测定其毒力。[结果]含毒尿囊液在冻干前后对鸡胚的毒力不变。毒力试验结果表明该毒的毒力中等,可为雏鸡提供保护。M41株种毒的EID50和免疫原性在7代内无变化。湿毒在-15℃保存半年以内,其毒价基本不变。种子批建立后未受到细菌及其他微生物的污染。[结论]该种子批可以用于生产鸡传染性支气管炎疫苗。

鸡传染性支气管炎M_(41)株、T株及四川肾型SAIB_3株病理学比较研究

鸡传染性支气炎(Infectious Bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性高度接触传染病,主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿系统和生殖系统。60年代以前,人们认为本病主要损害幼鸡的呼吸器官和产蛋母鸡的生殖器官,但是,1962年Winter-field和Hitcher在美国首次分离出两株能引起鸡肾脏病变的传染性支气管炎病毒(IBV),随后,Cumncing(1963)在澳大利亚也分离到1株肾病型IBV,并命名为澳大利亚T株。此后很多国家均有此病报道。

鸡传染性支气管炎病毒广西株N、M基因的克隆与序列分析

为研究鸡传染性支气管炎病毒（IBV）广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了1株IBV。参照GenBank中IBV的核苷酸序列设计2对引物,利用RT-PCR技术对分离毒株的N、M基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,N基因序列全长为1 230bp,编码409个氨基酸,M基因序列全长为678bp,编码225个氨基酸。与参考毒株相比,分离株的N基因核苷酸序列同源性为87.2%~93.3%,推导的氨基酸序列同源性为90.0%~94.4%;M基因的核苷酸序列同源性为83.6%~91.0%,推导的氨基酸序列同源性为82.7%~92.9%。在遗传进化树中,本试验分离株Guangxi156株与BJ株和LX4株两个参考株位于同一个分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明,本试验分离株是一株新的IBV变异株。

鸡传染性支气管炎病毒M41株和Conn株的血清交叉血凝抑制试验

本试验用系统血凝抑制(HI)交叉试验,对鸡传染性支气管炎病毒M41株和Conn株进行抗体区分。结果表明,M41株和Conn株标准抗原与M41阳性血清HI抗体效价在免疫后21d分别为8log2、5log2,相差3log2;免疫后28d分别为8log2、5log2,相差3log2;免疫后35d分别为8log2、5log2,相差3log2。M41株和Conn株标准抗原与Conn阳性血清HI抗体效价在免疫后21d分别为4log2、8log2,相差4;免疫后28d分别为4log2、8log2,相差4log2;免疫后35d分别为4log2、9log2,相差5log2。因此,用血清HI交叉试验能够将抗M41株和Conn株抗体区分开来。

5株鸡传染性支气管炎病毒M基因克隆及序列分析

利用RT-PCR技术成功扩增出5株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)分离株M基因全长cDNA,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上,获得M基因的重组质粒。序列分析表明,5株IBV分离株间的M基因核苷酸同源性为89.0%～100.0%,与参考毒株核苷酸同源性为85.7%～99.3%;在M蛋白遗传进化树中,5株IBV分离株分居3个群;分离毒株M蛋白的α-螺旋结构主要分布在N端前100个氨基酸残基的肽段区,其他的部分主要是β-折叠和无规则卷曲结构,表明IBV分离株M蛋白在基因序列和二级结构上相对保守。

不同来源鸡传染性支气管炎病毒M41株病毒特性的分析比较

为了比较2株不同来源的鸡传染性支气管炎病毒(M41)毒株的生物学特性、免疫原性及S1基因同源性。将TONG-IBV和MOU-IBV分别接种10日龄SPF鸡胚,观察鸡胚病变特点、计算病毒含量(EID50)、制备灭活疫苗进行免疫抗体效价检测,进行S1基因测序分析。试验结果表明:接种TONG-IBV株后鸡胚出血较严重,蜷缩程度较轻,接种MOU-IBV的鸡胚呈典型的蜷缩状;MOU-IBV组抗体效价高于TONG-IBV组抗体效价;同源性分析结果显示,MOU株S1与M41参考株S1(GenBank序列号MK937830.1)的同源性为99.7%,高于TONG株S1与M41参考株S1的同源性99.0%。以上结果显示,不同来源M41疫苗株的病毒特性出现了多样性变化。

喘咳停抗鸡传染性支气管炎病毒H_(52)株和M_(41)株感染的疗效试验

本研究主要通过喘咳停抗传染性支气管炎病毒H52株（IBVH52）鸡胚感染抑制试验和传染性支气管炎病毒M41株（IBVM41）雏鸡感染治疗试验来了解其对病毒引起的鸡呼吸道感染的疗效。试验I分为A1（IBVH52）、A2（IBVH52+中药煎剂）、A3（中药煎剂）和A4（空白）4组,鸡胚接种后120小时,A2组（30％）鸡胚死亡率比A1组（80％）低50％,A3组、A4组全部存活;活胚平均重A2组（6克）明显大于A1组（3.3克）,与A3组（7.9克）和A4组（7.8克）接近。试验Ⅱ分B1（喘咳停）、B2（对照药）和B3（空白）3组,IBVM41株感染鸡治疗3天后,B1组鸡只痊愈,10天后剖检病变不明显;B2组鸡只呼吸道症状减轻,但个别鸡只有继发感染,剖检见呼吸道内有少量粘液,肺脏纹理清晰;B3组鸡死亡3只,呼吸道症状明显,剖检见呼吸道内有大量粘液,肺脏纹理极为明显。以上试验结果表明,喘咳停具有明显的抗呼吸道病毒IBVH52株和M41株感染的作用。

我国鸡传染性支气管炎病毒地方分离株生物学特性的研究

从我国新疆维吾尔自治区某鸡场发病症状及病理变化疑似鸡传染性支气管炎的病鸡有出血点病变的腺胃组织中分离病毒 ,在 9～ 11日龄SPF鸡胚上连续传代 9次 ,通过病毒对鸡胚的致病作用、病毒在电镜下的形态观察、病毒在鸡胚中的增殖动态变化、病毒在CEF中的增殖特性、凝集鸡红细胞的特性以及动物回归试验等来研究我国鸡传染性支气管炎病毒地方流行株的生物学特性。结果表明 ,该毒株的第一代尿囊液对鸡胚无肉眼可见的致病作用 ,当继代到第 5代后 ,胚体严重病变 ;电镜观察该病毒为典型的冠状病毒 ;病毒在鸡胚中随着接种病毒时间的延长 ,其效价增高 ,96小时可达到 48小时的 1倍 ,该毒株可在CEF上生长 ,但不能形成明显的蚀斑 ;并且经 1%胰酶处理后可凝集鸡红细胞 ;鸡胚的第 4代尿囊液病毒回归动物体 ,可致鸡病变病死鸡肾脏病变尤为明显 ,呈典型的花斑肾 ,腺胃则未见肉眼可见的病变 ,接种鸡、同居鸡和对照鸡之间NDV疫苗免疫后其HI抗体水平无明显差异 ,但从发病症状来看 。

2株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定与S1、M和N基因序列分析

为跟踪了解广东地区鸡传染性支气管炎病流行情况,2019年从广东省清远、惠州两地疑似鸡传染性支气管炎发病鸡群中采集分离到2株传染性支气管炎病毒,并对其进行了鉴定和分析。结果显示,在鸡胚上盲传3代后均出现鸡胚的典型病变,死亡鸡胚全身出血明显,未死亡鸡胚发育受阻,呈明显的侏儒胚、蜷缩。将2个分离株分别命名为CK/CH/GD/QY1119和CK/CH/GD/HZ1225,分别测定其半数感染量(EID 50),扩增其S 1、M和N基因核苷酸序列,获得相应的推导氨基酸序列并对其分析。分离株CK/CH/GD/QY1119和CK/CH/GD/HZ1225的EID 50分别为10-7.5/0.1 mL和10-6.75/0.1 mL,2个分离株S 1基因与Mass型等疫苗株同源性为76.2%~82.1%,同源性均较低。与H120疫苗株相比,2个分离株的S 1、M和N基因存在若干氨基酸的差异,2个分离株S 1基因均存在氨基酸的插入,分离株CK/CH/GD/QY1119的M基因存在氨基酸的缺失,分离株CK/CH/GD/HZ1225的M基因存在氨基酸的插入。进化树分析显示,2个分离株分别属于LDT3型分支和QX型分支,均在S 1、M和N基因进化树上的分属上存在差异。结果表明本次分离得到的2个分离株的S 1、M和N基因均存在不同程度变异,在临床防控中应引起重视。本试验为鸡传染性支气管炎的有效防控提供了参考依据。

鸡传染性支气管炎病毒中国分离株LX4纤突蛋白基因分子特征

应用RT PCR方法分别扩增了中国地方分离株IBVLX4S1和S2基因并进行了基因的克隆和序列测定。结果发现 ,LX4S基因由 3495个核苷酸组成 ,编码一条 1 1 6 4个氨基酸残基组成的多肽。S基因编码产物裂解后形成的S1和S2亚单位分别由 5 39和 6 2 5个氨基酸残基组成。LX4S基因推导氨基酸切割识别位点序列为HRRRR ,与A2、SD/ 97/ 0 2和Z株相同 ,而与其它国内外参考毒株不同。与国内外 1 0株已报道的具有全S基因序列的IBV参考毒株比较 ,LX4与国内分离毒株SD/ 97/ 0 2的核苷酸和氨基酸同源性最高。与 32株国内外参考毒株的S1基因进化树分析比较表明 ,LX4与A2、SD/ 97/ 0 2、Z、TJ/ 96 / 0 2、JX/ 99/ 0 1和SAIBWJ等 7个国内分离株在同一亚群内。在该亚群内 ,LX4与A2和SD/ 97/ 0 2亲缘关系更近 ,且三者在高变区和抗原表位均具有高度的同源性 ,而与本亚群内其它参考毒株对应的高变区和抗原表位同源性差异较大。LX4与H1 2 0S1基因编码氨基酸的同源性虽然高于其它国外参考毒株 ,但同源性仍然较低 ,为 75 %。与参考毒株比较 ,LX4S2基因的点突变造成其推导的氨基酸序列有 1 1个位点发生改变 ,这些突变可能影响S2与S1蛋白之间的相互作用 。