鸡传染性支气管炎病毒H52毒株S基因的克隆及序列分析

将含有鸡传染性支气管炎病毒 (IBV) H5 2毒株的尿囊液浓缩 ,用 TRIzol试剂抽提病毒 RNA作为反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)的模板 ,参照已发表的 IBV- Beaudette株 S基因序列 ,设计并合成一对特异性引物 ,扩增得到长度约 3.6 kb的 S基因片段 ,利用引物设计中 Eco R I和 Bam H I酶切位点插入到克隆载体 p Blue Script SK的多克隆位点中 ,转化感受态 E.coli DH5 α。经酶切分析和 PCR等方法鉴定 ,筛选出阳性克隆 ,进行核苷酸序列测定 ,证实获得了 S基因的全长序列。利用 DNAstar等分析软件与 Gen Bank中其它 IBV毒株的核苷酸及其推导的氨基酸进行序列同源性比较分析 ,结果表明 ,H5 2毒株与已报道的核苷酸的同源性在 83.4 5 %～ 99.71%之间 ,氨基酸的同源性在 82 .10 %～ 99.2 6 %之间。

鸡传染性支气管炎病毒H52株TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究建立了一种快速的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52株定量检测方法,为进一步研究疫苗的效价检测和质量监控新方法奠定基础。针对IBV核蛋白(N)基因,设计特异的H52株荧光定量PCR检测引物和TaqMan-MGB探针,优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验,探讨荧光定量RT-PCR与EID50方法测定病毒含量的相关性,并通过体外转录技术对病毒基因拷贝数进行定量分析。该方法特异性强,与其他禽源病毒均无交叉反应;该方法可检测到5.60×101拷贝/μL的病毒核酸,与常规PCR相比,敏感性高10倍;重复性试验的变异系数为0.9%～3.2%;与EID50检测结果的相关系数r=0.934,两种方法在检测H52株病毒效价上具有很好的相关性。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法,适合于对鸡传染性支气管炎病毒H52株病毒含量的快速定量检测。

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)S1基因序列 ,设计了一对引物并以RTPCR特异性扩增出IBVH5 2疫苗株的S1基因 ,基因产物大小为 1.62kb ,与设计相符 .对其进行序列测定后 ,与其他标准毒株H12 0 ,M 41,BEAU株的S1基因进行同源性比较 ,结果表明 ,H5 2株与H12 0 ,M 41和BEAU株的核苷酸序列的同源性分别为 91.1% ,96.9%和 96.8% ,由此可以看出 ,IBVH5

鸡传染性支气管炎病毒H_(120)株细胞适应毒的培育研究

以IBH120鸡胚毒适应成纤维细胞(CEF)单层,培养出IBH120细胞弱毒株.电镜观察,可见典型的冠状病毒粒子.IBH120细胞弱毒株经细菌、霉菌、支原体、鸡白血病病毒检测均为阴性,且具有IB病毒特异性.CEF单层接毒后48h左右病毒增殖达到高峰.随着细胞传代次数的增加,C4～C10代H120株细胞毒的毒价(TCID50)逐步增高而趋于稳定,C4～C10代细胞毒的TCID50稳定在107.35～8.0mL之间,而C5～C10代IBH120细胞毒的EID50呈下降趋势,变动范围在107.3～106.5mL.以103.5TCID50/只和104.5TCID50/只的剂量,C4,C8,C10代毒分别滴鼻接种3日龄敏感鸡,免疫鸡的攻毒保护率为80%～100%,病毒分离回收率分别为20%和0.

传染性支气管炎病毒疫苗株H52的全基因组克隆与分析

采用RT-PCR方法克隆测定传染性支气管炎病毒（Infections Bronchitis Virus，IBV）疫苗株H52全基因组序列，并与其它已知全基因组序列的我国分离株进行比较分析，以分析我国IBV地方分离株与疫苗株的分子遗传关系。结果表明，H52基因组全长为27630bp（不包括polyA），A＋T含量为61．8％，它与我国IBV分离株全基因组同源性在83．9％～95．2％之间，其中与KQ6的同源性最高（95．2％），与其余株均在88％以下。在基因组内基因的同源性中，以S1、S2与E变异最大，除KQ6外，其余各株（含台湾株）与H52在S1蛋白上的同源性只有72．4％～80．7％，在S2蛋白上的同源性为85．5％～88．1％，E蛋白为82．9％～93．3％。系统进化分析表明，国内分离株，除KQ6外，在进化分支中已独立于H52和其它Massachusetts型衍生毒株。H52与我国地方分离株存在较大的分子遗传差异，这些差异可能导致单纯Massachusetts型疫苗（如H120，H52）不能有效地免疫保护我国的鸡群。

喘咳停抗鸡传染性支气管炎病毒H_(52)株和M_(41)株感染的疗效试验

本研究主要通过喘咳停抗传染性支气管炎病毒H52株（IBVH52）鸡胚感染抑制试验和传染性支气管炎病毒M41株（IBVM41）雏鸡感染治疗试验来了解其对病毒引起的鸡呼吸道感染的疗效。试验I分为A1（IBVH52）、A2（IBVH52+中药煎剂）、A3（中药煎剂）和A4（空白）4组,鸡胚接种后120小时,A2组（30％）鸡胚死亡率比A1组（80％）低50％,A3组、A4组全部存活;活胚平均重A2组（6克）明显大于A1组（3.3克）,与A3组（7.9克）和A4组（7.8克）接近。试验Ⅱ分B1（喘咳停）、B2（对照药）和B3（空白）3组,IBVM41株感染鸡治疗3天后,B1组鸡只痊愈,10天后剖检病变不明显;B2组鸡只呼吸道症状减轻,但个别鸡只有继发感染,剖检见呼吸道内有少量粘液,肺脏纹理清晰;B3组鸡死亡3只,呼吸道症状明显,剖检见呼吸道内有大量粘液,肺脏纹理极为明显。以上试验结果表明,喘咳停具有明显的抗呼吸道病毒IBVH52株和M41株感染的作用。

鸡传染性支气管炎病毒肾型毒株血凝特性的研究

本文对鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）澳大利亚Ｔ株和分离的四株肾型毒株（ＢＪ＿（９３０１）、ＢＪ＿（９３０２）、ＴＪ＿（９３０１）、ＨＮ＿（９３０１）株）的血凝特性进行了系统研究。结果表明ＩＢＶ供试毒株经１～２％胰蛋白酶处理后，能凝集鸡和小鼠红细胞，同一毒株对两种红细胞的凝集价相近，且均能被ＩＢＶ澳大利亚Ｔ株血清所抑制。处理后的ＩＢＶ对鸡红细胞的血凝以缓冲液浓度０．０１～０．０５ＭｐＨ６．０～８．４为宜，对反应温度及稀释液种类无严格要求。ＩＢＶ的血凝活性能耐受３７℃２３天、５６℃１２小时、８０℃１．５小时，但在－３０℃、４℃和室温下保存２个月后，绝大部分丧失血凝活性。ＩＢＶ经０．２％甲醛、０．２％脱氧胆酸钠、２％硼氢化钠、０．０１Ｍ高碘酸钠３７℃灭活２４小时，仍能保持其血凝活性。从ＩＢＶ的血凝活性可被过量胰蛋白酶破坏和氯仿灭活，推断该血凝素可能是由脂质和蛋白质组成。

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒强毒株的培育

用腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒分离株 IBV-D971株接种 1日龄 SPF鸡 ,连续传 1 0代后 ,培育出了腺胃病变型鸡传染性支气管炎强毒株 IBV-D971 J株。 IBV-D971 J1 0 对 SPF鸡胚的致病力为 1 0 - 6 .45ELD5 0 /0 .2 m L,对 1日龄 SPF鸡的致病力为 1 0 - 1 .5 LD5 0 /1 m L。从死亡鸡的心、肝、脾、肺、肾、腺胃、肌胃、法氏囊等均能分离到 IBV,IBV-D971 J1 0 不含鸡新城疫、禽流感、鸡马立克氏病、鸡传染性法氏囊炎、网状内皮组织增殖病等外源病毒。对 SPF鸡可引起典型的腺胃炎、肌胃炎。

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒(IBV-D971株)致弱的研究

将IBV_D971株病毒在SPF鸡胚上连续传至 12 0代 ,培育出了一株毒力明显减弱 ,并且具有良好免疫原性的腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒弱毒株 (IBV_D971株 )。IBV_D971F10 5代毒力明显下降 ,以 10 9.2 5EID50 接种 1日龄SPF鸡 5 / 5无不良反应。IBV_D971F10 5代毒连续通过 1日龄SPF鸡体 5代 ,未见毒力返强。以 10 3EID50 免疫 1日龄SPF鸡 ,攻毒后 5 / 5保护 ,对照 5 /

鸡腺胃型传染性支气管炎病毒金坛分离株核蛋白基因分析及与标准强毒株同源性比较

根据已发表的鸡传染性支气管炎病毒 (infectious bronchitis virus,IBV) Beau株、M41株的核苷酸序列 ,设计并合成 1对引物。应用该引物 ,通过 RT- PCR扩增出 IBV金坛分离株 (JT株 )的核蛋白基因 (N基因 ) ,片段大小为 82 8bp,与设计相符。对 JT株的 N基因进行序列测定 ,并与标准毒株 KB85 2 3、CU - T2、Beau和 M41的 N基因进行同源性比较 ,结果表明 ,JT株与 KB85 2 3、CU- T2、Beau和 M41毒株的 N基因同源性分别为 87%、87%、86 %和 85 %,说明 JT株与标准毒株在 N基因上存在一定的差异。

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒D971毒株S1基因的序列测定与分析

采用RT PCR方法扩增了鸡传染性支气管炎病毒D971毒株预期的 163 6bp的S1全基因DNA片段 ;以Sanger’s双脱氧末端终止法测定出其核苷酸序列 ,推导出了氨基酸序列 ,并用有关软件构建了S1基因进化树。结果表明 ,IBV D971毒株与国内外AF14 0 3 5 2 (山东农业大学 )、AF15 4841(山东农业大学 )、AF193 43 2 (青岛动物检疫所 )、AY0 43 3 12 (中国农业大学 )、AF3 975 2 8(四川农业大学 )、AY0 43 2 2 1(浙江农业大学 )、AF3 5 2 3 12 (浙江农业大学 )、U2 95 2 2 (澳大利亚 )和M2 1883 (英国 )毒株的核苷酸同源性分别为 99%、99%、95 %、94%、87%、86%、88%、82 %和 80 % ,氨基酸序列同源性依次分别为 93 %、93 %、87%、86%、83 %、83 %、82 %和 80 %。

鸡肾型传染性支气管炎病毒弱毒株的选育

从南京地区分离的肾病变型传染性支气管炎病毒(IBV)经SPF鸡胚连续传代至65代时 ,对雏鸡无致病性 ,命名为IBV -AT65,感染鸡胚的EID50 为10 -7.66/0.2mL ,鸡胚于接种后51h开始死亡 ,存活鸡胚表现为发育受阻、卷缩 ,肾脏有尿酸盐沉积 ,其尿囊液对1 %鸡红细胞凝集反应为阴性。用AT65 原液0.2mL分别于气管内接种10日龄AA鸡(攻毒前经血凝抑制试验检测IBV抗体为阴性),以及攻毒后将鸡舍降温到20℃12h ,观察20d ,均未发现有临床症状。剖杀攻毒鸡 ,肾脏无肿大及尿酸盐沉积现象 ,做病理切片未出现病理变化 ,表明该毒株确已致弱。将AT65 经10日龄SPF鸡盲传10代 ,无毒力返强现象 。

一株鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

2004年从贵阳市某鸡场发生的以呼吸道症状、肾肿大、输尿管有尿酸盐沉积为特征的病鸡群采集样品(肝、脾、肾),接种鸡胚,盲传3代,进行病原分离并将分离病毒命名为IB2。分离病原经过鸡胚传代可见胚体卷曲、发育阻滞、肾肿大、肾小管和输尿管有尿酸盐沉积的典型胚胎病变特征,经血凝性检测、对新城疫增殖的干扰试验证明该分离毒株为肾型传染性支气管炎病毒。

鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种保存期试验

对保存于中国兽医微生物菌种保藏管理中心的4个不同年代(1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月)冻干的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株毒种进行了对雏鸡的毒力和病毒含量测定试验,结果表明:4个不同保存年代的IBV M41株毒种均能使雏鸡100%出现鸡传染性支气管炎典型症状,病毒含量均≥10^(6.0)EID_(50)/0.1 mL。其中一支毒种在-70℃以下保存22年11个月,其毒力和病毒含量均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○年版)规定,能够满足检验需求。本试验为探寻IBV M41株毒种更加合理的保存期提供了参考。

我国鸡传染性支气管炎病毒地方分离株S1基因的分离及初步鉴定

根据IBVBeaudette株全基因组序列 ,借助基因分析软件自行设计合成了 3条引物 (you1+、you2 -、youM +) ,引物you1+和you2 -在S1基因两侧 ,跨幅为 16 11bp ,引物you2 -和youM +在S1基因的 3’端 ,跨幅为 5 35bp 用引物you1+和you2 -对 5个IBV地方分离株 (HN2、HN4、JX1、SC2和SC4)进行RT PCR ,均成功地扩增出预期大小的目的片段 用另 1对引物 (you2 -和youM +)对各毒株的RT PCR产物再进行PCR扩增 ,均得到一条约 5 30bp的目的片段 ;对RT PCR产物用限制性内切酶PstⅠ进行酶切分析 ,结果酶切产物中得到 2条条带 ,大小分别为 5 6 0和 10 5 0bp ,与GeneBank中 11株已发表的S1基因分析结果一致 初步鉴定结果显示 ,已经成功分离得到了IBV S1基因 .

H120活疫苗对部分基因型传染性支气管炎病毒的免疫保护效力

对LH、PZ、CZ-JT和JT等最新分离的传染性支气管炎病毒(IBV)进行S1基因序列分析和基因分型。结果表明:LH株和PZ株均属于QX基因型,但分属2个不同的基因亚群;CZ-JT株属于HN08基因型;JT株则属于CK/CH/LSC/99I基因型。用商品化传染性支气管炎活疫苗(H120株)对4个分离株和M41标准强毒株的免疫攻毒保护试验结果表明:H120疫苗能够对属于Mass-type的M41标准强毒株提供完全保护;对LH株和PZ株可提供临床保护,但试验鸡可检出较高比例的气管和肾脏排毒;对CZ-JT株和JT株只能提供部分临床保护,且试验鸡气管和肾脏排毒较为严重。研究结果提示Mass-type疫苗已经不能对当前流行毒株提供完全保护,迫切需要研制新的疫苗以适应生产的需要。

鸡传染性支气管炎疫苗株与广西流行野毒株鉴别方法的建立

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)3′端非编码区和S1基因保守区域设计两对特异性引物,对H120、Ma5和4/91、M41等常用疫苗株以及26株广西田间分离株进行二重RT-PCR扩增,并进行该方法的特异性和敏感性试验,同时进行了初步应用。结果表明,经RT-PCR扩增后,M41毒株得到约160bp的目的片段,Mass型毒株得到约370bp的目的片段,4/91型IBV毒株得到约480bp和345bp 2条目的片段,其他24株广西分离株得到1条大小在260bp^345bp的目的片段。特异性试验表明此二重RT-PCR方法不能扩增NDV、AIV、MDV、IBDV、ALV等,敏感性试验表明最低检测量达到100pg。该方法的临床应用表明,攻毒鸡病料阳性率达90%。研究结果表明了所建立的二重RT-PCR方法可以鉴别IBV疫苗株与广西流行野毒株,且特异性强,敏感度高。

银加强金标免疫技术在鸡传染性支气管炎病毒检测中的应用

采用胶体金标记纯化的羊抗鼠IgG,建立了一种对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)进行检测的银加强金标免疫技术(SECGA).先将抗原点样于硝酸纤维素膜(NCM)中央,封闭后浸于40×稀释的IBV单抗中作用10min,洗涤后再浸于体积比为1:4稀释的金标羊抗鼠IgG溶液中作用1h,银染10min后观察,在膜上出现灰黑斑点的为阳性结果,反之,不出现斑点为阴性结果.SECGA对IB抗原最低测量值为0.703ng·点-1(约2μL),对含毒尿囊液的最低检测为102..9EID50.结果表明,IB VM41毒株在鸡胚中繁殖时以36～54h检测含毒量最高;SPF鸡感染3d后可从气管粘液中检出病毒.SECGA检测抗原可用于IBV早期检测,具有群特异性,快速、敏感、简便,不需特殊设备,结果易判定等优点,尤适于基层实验室或现场应用.

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原表位多肽的预测、鉴定及免疫效果的初步研究

旨在对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120株S1蛋白的B细胞及T细胞可能的表位进行预测并合成相应的多肽,然后免疫小鼠,并分析其免疫效果,以验证候选表位多肽的免疫原性。利用表位预测软件筛选并化学合成针对IBV H120株S1蛋白的5条表位多肽,然后免疫小鼠,通过间接ELISA、中和试验和流式细胞技术检测各表位多肽诱导的特异性抗体、中和抗体和外周血T细胞亚群。ELISA检测结果显示,5条表位多肽均具有良好的反应原性,免疫小鼠的血清效价高低顺序依次为Pep76-106>Pep240-257>Pep511-537>Pep403-421>Pep135-172;中和试验结果表明,5条多肽免疫小鼠的血清中和滴度均高于空白对照组,其高低顺序依次为Pep240-257=Pep403-421=Pep511-537>Pep76-106=Pep135-172;流式检测结果表明,5条多肽免疫小鼠在CD3^+、CD4^+CD8-、CD8^+CD4-T淋巴细胞水平上均极显著高于空白对照组(P<0.01),CD3^+T及CD4^+CD8-T淋巴细胞数大小顺序依次为Pep403-421>Pep240-257>Pep76-106>Pep511-537>Pep135-172,CD8^+CD4-T淋巴细胞数大小顺序依次为Pep403-421>Pep76-106>Pep511-537>Pep240-257>Pep135-172。合成的5条表位多肽中,Pep240-257、Pep76-106和Pep403-421可以诱导体液免疫,Pep403-421可以诱导细胞免疫,其中,Pep403-421可以同时诱导细胞免疫及体液免疫。本研究结果为深入了解S1蛋白的免疫学特性以及研发诊断试剂和有效表位疫苗奠定了基础。