抗鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的VP2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗VP2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-VP2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗VP2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID 50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV VP2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。

一株鸡传染性贫血病毒对不同日龄SPF鸡的致病性研究

为评价鸡传染性贫血病毒AV1550株的致病性,取1日龄、7日龄和14日龄SPF鸡分别经胸部肌肉注射不同病毒含量的病毒液,同时设置正常对照,隔离饲养观察21 d。感染后14 d采血测定红细胞压积,21 d统计死亡率、体重变化以及胸腺、骨髓、法氏囊病变情况并测定1日龄SPF鸡感染后不同组织中的病毒载量。结果表明,1日龄SPF鸡感染AV1550株后,表现出精神沉郁、增重减缓、贫血等明显的临床症状,死亡率为53.9%;死亡鸡或观察期结束时存活鸡剖检,可见胸腺萎缩,骨髓变成淡黄色;不同剂量感染后14 d,均能引起红细胞压积显著下降;21 d时,胸腺病毒载量最高,可达10^(6.7) copies/mg。7日龄SPF鸡感染后,出现增重减缓,高感染剂量(100000EID_(50))出现贫血,部分鸡出现胸腺萎缩和骨髓病变,但病变率低于30%。14日龄SPF鸡感染后,不引起明显临床症状。研究证实,CAV对SPF鸡的致病性具有明显的日龄依赖性,红细胞压积降低、骨髓病变、胸腺萎缩以及胸腺病毒载量测定可作为评价CAV致病的指标。

一株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及致病性分析

为鉴定来自山东某种鸡场196日龄疑似鸡传染性贫血病毒(CAV)感染的2份种鸡肝脏样品的致病原,本实验利用马立克病肿瘤淋巴母细胞(MDCC-MSB1细胞)对2份肝脏样品进行病毒的分离培养与传代,每代均观察细胞是否出现细胞病变(CPE)。将传至5代的病毒液分别采用PCR和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,PCR结果显示,扩增到与CAV JL17株阳性对照一致的约600 bp的目的条带;IFA结果显示,感染分离病毒与JL17株阳性对照的细胞均出现绿色荧光,而阴性对照既未扩增到目的条带也无绿色荧光。上述结果表明分离到一株CAV,命名为SDNN2022。为分析SDNN2022株的分子特征,采用PCR扩增其VP1基因并测序,采用DNAStar软件对SDNN2022株VP1基因与GenBank登录的39株CAV参考株VP1基因序列进行同源性分析;采用Megalign分析SDNN2022株VP1的氨基酸序列,构建SDNN2022株VP1基因的进化树。VP1基因的同源性结果显示,SDNN2022株与CAV参考株的VP1基因序列的同源性为95.0%~99.8%,其中与CAV参考株JS2020-PFV的同源性最高;SDNN2022株VP1高变区的氨基酸位点(aa139~aa151)与大多数强毒株一致。但在aa89、aa92、aa411和aa417与大多数CAV参考株不同,均发生了氨基酸突变,分别为T^(89)K、G^(92)D、S^(411)T和V^(417)I,其中后两个位点的突变为本研究首次发现。SDNN2022株与CAV强毒参考株CUX-1的aa394均为谷氨酰胺,符合CAV强毒的分子特征,表明SDNN2022株为一株CAV强毒株。VP1基因的进化树结果显示,分离株SDNN2022与CAV参考株CUX-1、JS2020-PFV、CAV-JL190130等聚为一支,且与JS2020-PFV株的遗传距离最近,均属于A群,进一步表明SDNN2022株为一株强毒株。将该株病毒分别感染6胚龄SPF鸡胚和14日龄SPF雏鸡进行致病性试验,结果显示,SDNN2022株对鸡胚的致死率为30%(3/10),病死鸡胚体的肝脏黄化;该株病毒感染14日龄SPF雏鸡后7 d出现精神萎靡、呆滞、羽毛凌乱等临床症状,发病率为83.3%(5/6),但无死亡;感染后14 d,与空白对照组鸡相比,感染组鸡体重显著降低(P<0.05),胸腺明显萎缩,且胸腺指数极显著降低(P<0.01)。本研究分离到一株强毒力CAV,且对SPF鸡胚和雏鸡均具有较强的致病性,丰富了国内CAV的病毒资料,为深入研究CAV的致病机制提供了数据支持。

表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

鸡群中鸡传染性贫血病原与抗体检测及分离株VP1基因序列分析

为了解鸡群中鸡传染性贫血病毒(CAV)感染及抗体产生情况,从黑龙江省两个无临床症状鸡群(B群和S群)中,分别采集血清通过ELISA方法进行抗体检测,采集抗凝血并分离淋巴细胞,针对基因组保守序列设计引物,通过PCR方法进行病原检测,并对从B群病原阳性鸡分离到的分离株进行VP1基因序列分析。结果显示,B群和S群CAV抗体阳性率分别为62.7%(79/126)和68.2%(88/129),病原阳性率分别为43.0%(49/114)和62.3%(48/77),其中,B群和S群中抗体和病原双阴性的鸡分别为23.7%(27/114)和15.6%(12/77),而抗体和病原双阳性的鸡分别高达28.1%(32/114)和46.8%(36/77);在双阳性鸡中,B群和S群分别有62.5%(20/32)和58.3%(21/36)抗体滴度在1.0×10^(4)及以上,从B群病原阳性鸡全血中分离到一株CAV(HLJ/2022株),分离株HLJ/2022第394位氨基酸为谷氨酰胺,具有强毒的分子特征;两个鸡群的环境拭子CAV阳性率为10.0%(3/30),存在于消毒前的鸡蛋表面、更衣处和鞋底。研究表明,检测鸡群的CAV抗体阳性率在62.7%以上,病原阳性率在43.0%以上,抗体滴度在1.0×104及以上CAV仍可存在,CAV流行株(HLJ/2022)具有强毒分子特征,鸡群环境中存在CAV污染,结果为CIA防控提供重要的参考意见。

湖北荆州地区鸡传染性贫血病病毒的流行病学调查及致病性分析

为了调查鸡传染性贫血病病毒(CAV)在肉鸡群中的流行情况及CAV毒株的致病性,于2021年在湖北荆州地区收集鸡肝样品224份,采用PCR方法进行检测,并对CAV的全基因扩增片段克隆测序,用生物信息学软件对测序结果进行遗传进化及分子特征分析;通过动物回归试验探究分离毒株JZ2118的致病性。结果显示,18份样品为CAV阳性,CAV阳性率为8.04%。CAV全基因序列与CAV VP1氨基酸序列的遗传进化树分组基本相同,说明CAV的遗传进化主要与VP1蛋白氨基酸的突变有关;1日龄SPF鸡感染JZ2118毒株14 d后致死率高达82.6%,在体重、病毒载量、血常规检测与病理组织切片等方面都具有显著性变化,表明JZ2118分离株是具有较强致病性的强毒株。

鸡传染性贫血病毒抑制干扰素的研究进展

鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)为目前已知的指环病毒科(Anelloviridae)环病毒属(Gyrovirus)的唯一成员。CIAV直径为19~26.5 nm,无囊膜,由12个五边喇叭状的衣壳体组成二十面体结构的衣壳。CIAV对高温和化学试剂有较强抵抗力,100℃下处理15 min才能完全失活,对氯仿、乙醚和丙酮等试剂的处理也很不敏感~([1])。CIAV基因组是单链共价环状DNA,全长约2.3 kb,编码3个病毒蛋白;VP1为衣壳蛋白,是病毒颗粒中唯一的蛋白质~([3]);VP2具有多种功能,对病毒颗粒的形成至关重要~([4]);VP3在体内外可引起细胞凋亡~([2])。

感染鸡传染性贫血病毒(CIAV)雏鸡免疫器官抗体生成细胞的动态变化

对１日龄雏鸡感染鸡传染性贫血病毒（ＣＩＡＶ）后免疫器官法氏囊、脾脏和胸腺的ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ抗体生成细胞数量的动态变化进行了检测。结果发现，感染雏鸡法氏囊、脾脏和胸腺的３种抗体生成细胞数量均程度不同地低于未感染对照雏鸡，其中法氏囊的ＩｇＧ、ＩｇＭ抗体生成细胞和ＩｇＡ抗体生成细胞分别在感染后７～３５ｄ和１４～３５ｄ明显减少；脾脏红髓、白髓和淋巴小结的ＩｇＧ抗体生成细胞分别于７～３５ｄ、１４～３５ｄ和１４～２１ｄ明显减少，ＩｇＭ抗体生成细胞分别在７～４２ｄ、２８～３５ｄ和１４ｄ时明显减少，ＩｇＡ抗体生成细胞仅在红髓中（７～２８ｄ）明显减少；胸腺髓质的ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ抗体生成细胞分别在１４～２８ｄ、７～２１ｄ和２１ｄ时明显减少。结果表明，ＣＩＡＶ感染雏鸡免疫器官的体液免疫功能明显降低。

3株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定、VP1基因遗传进化分析及致病性评价

为了解国内鸡场鸡传染性贫血(CIA)的流行状况和鸡传染性贫血病毒(CIAV)的遗传变异规律,以期对CIA的传播流行和预警防控提供技术支持。本试验对2020年在3个省份疑似发生CIA的3个规模鸡场采集10份组织脏器样品,应用鸡胚进行病毒的分离培养,并对培养物进行CIAV PCR检测,进而对CIAV阳性样本进行VP 1基因扩增和测序,应用Lasergene和MEGA 6.0软件,对获得的所有分离毒株结构蛋白VP 1基因序列与GenBank中CIAV参考毒株进行比对,构建系统发育进化树,同时对分离的CIAV毒株进行动物回归试验,评价其对鸡的致病性。结果显示,10份样品中3份为CIAV阳性,共分离到3株CIAV,分别命名为202006-NX-4-2、202006-SD-2-1和202006-JX-016。VP 1基因相似性分析显示,3株CIAV分离株核苷酸相似性介于97.7%~99.6%,且均与国内分离株具有较高同源性;氨基酸序列分析显示,3株CIAV分离株毒力相关位点均与国内强毒株GD-101株一致。遗传进化分析结果显示,3株分离株属于同一进化分支(Ⅱ分支),202006-SD-2-1株和202006-JX-016株与JL15120株进化关系最近,202006-NX-4-2株则与以国内强毒株GD-101株为代表的其他Ⅱ分支参考株进化关系最近。动物回归试验结果显示,3株CIAV均能够引起1日龄鸡发生严重的淋巴器官萎缩、骨髓黄化,为典型的高致病性病毒株特征。本试验结果为当前国内CIAV的流行、毒株的遗传变异分析及相关疫苗研发提供了参考依据。

禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒二重荧光LAMP检测方法的建立及应用

【目的】建立同时鉴别ALV和CIAV的二重荧光环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速诊断及有效防控ALV和CIAV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考ALV(A亚群、B亚群、C亚群、D亚群和J亚群)的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列,设计2套用于LAMP的特异性引物,并在ALV和CIAV的F1c和B1c覆盖区域分别设计双标记探针[ALV-Probe(5'端标记FAM荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团)和CIAV-Probe(5'端标记CY5荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团)]。在Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应结束后,将反应管置于多色荧光系统内进行观察分析;并通过特异性试验、灵敏度试验及临床样品检测验证二重荧光LAMP检测方法的适用性和可靠性。【结果】优化后的二重荧光LAMP反应体系20.0μL:DNA/cDNA模板2.0μL,2×ReactionMix 10.0μL,Bst DNA聚合酶0.8μL,内引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP(工作浓度40.0μmol/L)各0.8μL,外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3(工作浓度5.0μmol/L)各0.4μL,ALV-Probe(工作浓度0.5μmol/L)0.4μL,CIAV-Probe(工作浓度0.5μmol/L)0.8μL,以ddH_(2)O补足至20.0μL。扩增程序:62℃反应60 min,80℃灭活5 min。建立的二重荧光LAMP检测方法能特异性同时检测ALV和CIAV,对其他禽类病原体无特异性扩增;检测CIAV和ALV单一模板的下限均为102拷贝/μL,检测混合模板时ALV的检测下限为102拷贝/μL、CIAV的检测下限为103拷贝/μL。应用建立的二重荧光LAMP检测方法对13份咽喉和泄殖腔棉拭子样品进行检测,其检测结果与常规PCR检测结果的吻合率达100%。【结论】建立的二重荧光LAMP检测方法能实现在同一反应管内鉴别诊断ALV和CIAV,具有特异性好、敏感性高及污染风险小等优点,且检测结果可通过多色荧光系统进行肉眼观察,适用于ALV和CIAV的临床快速筛查。

鸡传染性贫血病毒与禽网状内皮增生症病毒二重PCR检测方法的建立

当前养鸡业中鸡传染性贫血病毒、禽网状内皮增生症病毒混合感染的发生率日益增高,为提高CIAV、REV检测效率,根据GenBank上登录的CIAV全基因序列和REV的LTR序列分别设计了2对引物,建立了REV、CIAV二重PCR检测方法,另外还比较了2种不同的DNA提取方法。结果显示,该方法扩增目的条带清晰、敏感性高、特异性好。应用建立的方法对临床7份病料样品检测,检出5份CIAV、REV阳性,表明建立的二重PCR方法能有效用于CIAV、REV混合感染的临床诊断。

鸡传染性贫血病毒与其他禽免疫抑制性疾病病毒的混合感染

应用多重PCR方法对广西主要养鸡地区的514只可疑鸡传染性贫血与其他禽免疫抑制性疾病临床病/死鸡进行了检测。结果显示,鸡传染性贫血病毒(CIAV)与其他禽免疫抑制性疾病病毒的二重或多重感染率达48.05%;CIAV阳性鸡群中,马立克氏病病毒(MDV)、网状内皮增生症病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)的群阳性率和个体阳性率均明显高于CIAV阴性鸡群,表明CIAV的感染与3种肿瘤病病毒的感染具有明显相关性,其中CIAV与MDV的感染具有明显相互促进作用;被调查鸡群中,传染性法氏囊病病毒(IBDV)和禽呼肠孤病毒(ARV)也有一定的感染率。结果表明,商业鸡群中各种免疫抑制性病毒的混合感染很普遍,与鸡群临床上所表现的生长阻滞、疫苗免疫效果不佳、总的发病率和死淘率增加等密切相关。

4株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

为了解广东地区鸡传染性贫血病毒(CAV)的流行和变异情况,本研究于2014年从广东省大型鸡场采集了12份可疑样品,经PCR鉴定、全基因组测序分析和动物回归试验,共分离得到4株CAV(GD-101、GD-102、GD-103和GD-104)。动物实验结果显示:4株CAV能够引起鸡严重的骨髓黄化和胸腺萎缩,具有典型的高致病性病毒株特征。遗传进化分析结果表明,4株分离株处于同一进化分支(II分支),GD-101和GD-102株与中国GD-B-12株进化关系最近,GD-103及GD-104株与中国SC-SM株进化关系最近,表明本研究所分离到的4株CAV均为高致病性的II分支病毒株,本研究为深入研究广东地区CAV的流行情况提供了参考依据。

PCR和斑点杂交检测鸡传染性贫血病毒

通过聚合酶链反应（ｐｃＲ）扩增鸡传染性贫血病毒（ｃＡＶ）ＤＮＡ特定片段，将此ｐｃＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记后作为探针进行斑点杂交，以此检测ＣＡＶ并作流行病学调查。对从江苏省不同地市随机采集的２月龄左右不同疾病的病鸡ＤＮＡ样品进行检测，在被检的５２个不同鸡群来源的病料中，有３６个鸡群来源的病料ＤＮＡ显示ＣＡＶ阳性（群阳性率为６９．２％）；备组织中ＣＡＶＤＮＡ含量有所差异，依次为胸腺＞脾、骨髓、肝＞肾、法氏囊、脑。用ＰＣＲ检测得到的阳性鸡的组织病料感染ＳＰＦ鸡，在感染后第２４天检查，出现贫血症状。初步调查表明，在江苏一些地区ＣＡＶ感染已相当普遍，但它与发病的关系还有待于进一步研究。

鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其在疫苗污染检测中的应用

为了更快速而灵敏地检测禽弱毒疫苗中鸡传染性贫血病毒(CIAV)的污染,根据CIAV基因组保守序列设计合成了引物及TaqMan探针,通过优化反应条件建立了快速检测CIAV的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的检测方法灵敏度可达10拷贝·μL^(-1),比常规PCR灵敏度高100倍。该方法与禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒以及马立克病病毒等病毒基因均无交叉反应,具有很好的特异性;批内重复和批间重复显示变异系数均小于2%,呈现良好的可重复性。在模拟试验中,该方法能够检测到1 000羽份弱毒疫苗中1个EID50的低剂量污染,应用该方法从送检的39种(批)商品化禽用弱毒疫苗中检测到2份为CIAV阳性。上述结果表明,本研究建立的荧光定量PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,可用于检测疫苗中CIAV低剂量的污染。

鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病毒基因组保守区域设计1对扩增片段为164 bp的特异性引物,应用SYBR GreenⅠ染料建立了鸡传染性贫血病毒(CIAV)荧光定量PCR检测方法。以本室构建的阳性重组质粒作为模板,制定标准曲线,对CIAV阳性样品进行了敏感性、特异性和重复性、稳定性试验,并应用于临床检测。结果表明引物最佳终浓度为0.2μmol/L,制作的标准曲线定量浓度范围宽,最低可检测到每个反应相当于10个拷贝的标准品DNA;与IBDV、ARV、MG都不反应;重复性、稳定性试验的变异系数都较小。对保存的25份疑似CIAV样品进行荧光定量PCR检测,结果检出9份阳性。本研究建立的荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上鸡感染CIAV的检测。

家禽活疫苗中鸡传染性贫血病毒PCR检测方法的建立

为建立不依赖于病毒分离的快速,特异的禽活疫苗中鸡传染性贫血病毒(CAV)监测方法,本研究建立了CAV的PCR检测方法。试验表明:该PCR不仅具有良好的CAV特异性,且检测灵敏度达3.98个TCID50/反应。用该方法监测9份随机抽取的商品禽用活疫苗发现,其中2份活疫苗呈PCR强阳性。以上结果表明,本研究建立的鸡传染性贫血病毒PCR检测方法具有特异、敏感等特点,能用于禽用活疫苗中CAV污染的快速监测。

鸡传染性贫血病毒广西株全基因组的克隆与序列分析

为了解鸡传染性贫血病毒（CIAV）广西分离株全基因变异情况,设计3对特异性引物,对CIAV广西分离株（GXC060821）的全基因进行PCR扩增、克隆和序列分析。结果显示,广西分离株的全基因为2 292个核苷酸,含有3个互相重叠的开放阅读框（ORF）。序列分析表明,本CIAV分离株与国内外其他31个CIAV毒株比较核苷酸的同源性在96.1%~98.5%之间,推导氨基酸的同源性在89.8%~94.2%之间。全基因系统发育进化树分析显示,广西分离株和中国的TJBD40株、LF4株都处于一个分支,它们的亲缘关系较近,而与美国的98D06073分离株及中国的HA4分离株的亲缘关系较远。

鸡传染性贫血病毒VP2基因的表达及其免疫活性分析

利用特异性引物从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒核酸经PCR扩增得到VP2基因,BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理,纯化后,克隆至BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理的表达载体pET-28a中,构建了原核表达质粒pET-28-VP2。将pET-28-VP2转化至感受态E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约31kDa的目的蛋白以可溶性形式表达于上清中。Western blot分析发现,表达产物与鸡传染性贫血的阳性血清发生特异性反应。纯化蛋白免疫小鼠后制得的多抗可以与全病毒发生反应,证明其具有免疫原性,为进一步研究VP2蛋白的功能及开展CIAV疫苗及诊断试剂的研制奠定了基础。

鸡传染性贫血病毒的分离鉴定

本试验于1992年自东北某地疑似鸡传染性贫血(Chicken Infectious Anemia—CIA)鸡群得到一分离物,该分离物能抵抗70℃5分钟处理,对氯仿不敏感,不凝集鸡、小白鼠、绵羊红细胞,可引起1日龄SPF鸡发病,表现出传染性贫血的特征病变,分离物能被鸡传染性贫血病毒(Chicken Anemia Virus CAV)抗血清中和,能在MDCC-MSB_1细胞上适应增值并与参考毒GiFu-1,CUX-1,TK5803在该细胞培养中产生一致的细胞病变,分离物与参考毒感染的MDCC-MSB_1细胞用间接免疫荧光(IFA)检测均见到核内颗粒荧光,分离物与参考毒GiFu-1细胞培养液负染后电镜观察可见到20nm大小无囊膜,六角形或近圆形的病毒粒子,其形态大小一致,因此可以认为分离物是CAV。