鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌PCR-RFLP鉴别

根据鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌flic基因可变区两端的保守序列设计1对引物,PCR扩增出约866 bp的产物,用Hinp1I对PCR产物进行酶切,经RFLP分析区分鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌。利用该技术对1株鸡白痢沙门菌标准株及2株鸡伤寒沙门菌标准株进行分子鉴别,结果与预计的RFLP模式相符,证明该方法可行。在此基础上对分离株进行鉴别,证明分离株均属于鸡白痢沙门菌。

鸡白痢与鸡伤寒沙门菌双重PCR方法的建立和初步应用

分析不同血清型/生物型沙门菌全基因组序列筛选出鸡白痢和鸡伤寒沙门菌特异性基因组序列,设计两对引物,建立双重PCR方法鉴别检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌不同生物型,并进行初步的临床应用。双重PCR方法结果显示,鸡白痢沙门菌显示417 bp条带,鸡伤寒沙门菌显示417 bp和636 bp两个条带,而阴性对照未出现条带,与预期设计相符。双重PCR体系对56株不同血清型沙门菌鉴定结果与细菌学分离的血清型鉴定结果完全一致,说明本试验建立的双重PCR体系特异性良好,应用上述方法检测鸡场疑似20份临床样本,结果发现8株鸡白痢沙门菌阳性,1株鸡伤寒沙门菌阳性。上述结果表明,已建立双重PCR方法特异性检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。本试验为鸡白痢和鸡伤寒不同生物型沙门菌的检测提供了一种简洁、敏感、特异的新方法。

鸡白痢、鸡伤寒沙门菌分子分型方法的验证

为验证鸡白痢、鸡伤寒沙门菌分子分型方法的准确性,本研究以3株鸡白痢、鸡伤寒沙门菌国际参考菌株和306株国内分离株为研究对象,采用5种已知的分子分型方法开展验证性实验。结果发现,基于特定基因可变区的2种分型方法具有良好的特异性,其检测结果与生化分型结果一致,而3种基于特定基因单核苷酸多态性的分型方法则出现假阳性或假阴性的结果。上述结果表明,鸡白痢、鸡伤寒沙门菌分子分型方法的准确性仍需进一步验证。

一株高致病性鸡伤寒沙门菌的分离与鉴定

对某蛋鸡场送检的10日龄左右病死雏鸡,进行了病理剖检,并开展了病原微生物分离培养、PCR鉴定、生化鉴定、血清学分型、动物回归、药物敏感性试验。结果显示,分离菌株为革兰氏阴性小杆菌,能够与鸡白痢鸡伤寒沙门菌阳性血清产生明显的凝集,PCR结果证实该分离株为鸡伤寒沙门菌;动物回归试验中,分离的鸡沙门菌具有较强的致病性;药物敏感性试验表明,分离株对替米考星、磷霉素、阿莫西林耐药,使用敏感药物氟苯尼考对鸡群沙门菌的控制取得了良好的治疗效果。

海兰褐蛋鸡感染鸡伤寒沙门菌的诊断

某蛋鸡养殖场90日龄海兰褐蛋鸡疑似沙门菌感染,为确定病原,对该鸡群随机采血,通过平板凝集试验进行鸡白痢-鸡伤寒沙门菌的血清学诊断,同时,无菌采取病鸡肝脏进行了细菌分离培养、生化鉴定及药敏试验。结果,血清阳性率达54.5%,分离菌在麦康凯琼脂上形成无色、透明、有光泽的圆形菌落,能发酵甘露醇、甘露糖、蕈糖、果糖、麦芽糖,不能发酵乳糖、棉子糖、蔗糖,鸟氨酸脱羧试验阴性,符合鸡伤寒沙门菌的生化特性。分离菌对头孢吡肟、头孢噻肟、氟苯尼考及丁胺卡那敏感,而对环丙沙星、氧氟沙星及强力霉素等耐药。表明该鸡群受到了鸡伤寒沙门菌的感染,采取了综合防治措施,病情得到有效控制。

鸡伤寒沙门菌减毒株1009ΔspiCΔcrp的保护效力评价

目的为研制安全有效的鸡伤寒沙门菌减毒活疫苗,该实验对鸡伤寒沙门菌减毒株1009ΔspiCΔcrp的安全性及保护力进行观察。方法以1×108集落形成单位的1009ΔspiCΔcrp对3日龄雏鸡口服免疫,在7 d后进行再次免疫,测定雏鸡的体质量变化、血清抗体水平和细胞因子水平,并对SG9强毒株攻毒后的保护力进行评价。结果免疫组鸡的体质量增长与对照组无明显差异,血清IgG水平持续上升并显著高于对照组,白细胞介素4(IL-4)、IL-6和IL-1β的水平也升高。以SG9强毒株攻击后,免疫组的保护率为100%,而对照组为20%。HE染色结果显示,免疫组鸡无病变,而对照组鸡脏器病变明显。结论1009ΔspiCΔcrp具有良好的安全性和免疫原性,是防治鸡伤寒理想的疫苗候选株。

新型凝集技术快速检测鸡白痢、鸡伤寒沙门菌

为探求鸡白痢、鸡伤寒沙门菌快速检测的新型凝集技术，尝试用3种有机活性染料与抗体分别修饰二氧化硅活性微球制成免疫彩色二氧化硅微球（ICSN），构建快速检测鸡白痢、鸡伤寒沙门菌新型凝集技术。利用反相微乳法制备彩色二氧化硅纳米微球（CSN），用扫描电镜表征形貌特征和分散程度，通过凝集现象表征对鸡白痢、鸡伤寒沙门菌的检测效果。结果表明该新型凝集技术灵敏度好，其凝集结果醒目、直观、易于肉眼判别，且耗用抗体不到常规凝集试验的1／500，对目标菌的检测范围为10^2～10^9cfu·mL-1；重复性和稳定性好，4℃放置28d后，凝集效果与放置前无显著差异；具有较好的特异性和准确性。用ICSN构建的新型凝集技术具有灵敏、经济、稳定、简便、快速、准确等优点，不仅适用于快速检测鸡白痢、鸡伤寒沙门菌，还可为其它致病微生物快速检测提供基础模型。

双重放大酶免疫传感器检测鸡白痢鸡伤寒沙门菌

为探求新型鸡白痢鸡伤寒沙门菌快速检测技术,本研究首次利用多壁碳纳米管与离子液体[BMIM]PF6修饰四通道丝网印刷碳电极,制成双重放大信号检测鸡白痢鸡伤寒沙门菌的酶免疫传感器。用原子力显微镜表征其表观形态,循环伏安法监测其电化学特性。结果表明,在优化的检测条件下,免疫电极对目标菌的线性响应范围为103～109 cfu.mL-1,检出限为3.93×102 cfu.mL-1(S/N=3),4℃放置28d后,响应电流为初始值的90.15%,具有良好的稳定性、特异性、重现性和准确性。多壁碳纳米管与离子液体结合制备的鸡白痢鸡伤寒沙门菌酶免疫传感器实现了检测信号的双重放大,检测灵敏度高,离子液体有助于保持酶标抗体的活性,延长免疫电极的有效时间。依据该方法构建的酶免疫传感器为快速检测其它致病菌酶免疫传感器的研究提供了良好的参照模型。

鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp的构建及鉴定

为研制安全有效的鸡伤寒沙门菌减毒株,首先利用自杀质粒介导的同源重组技术构建鸡伤寒沙门菌1009株的spic基因缺失株1009Δspic,在此基础上,运用λ噬菌体同源重组系统进一步敲除crp基因,以构建鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建出双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。生物学特性研究结果显示,1009株spic和crp基因的缺失能够得到稳定的遗传,部分生化特性发生了变化,生长速度较缓慢,对雏鸡的LD50升高了107倍。本研究获得的高度安全的鸡伤寒沙门菌减毒株为进一步研制鸡伤寒沙门菌减毒疫苗奠定了基础。

惠州地区鸡白痢和鸡伤寒沙门菌病血清学调查

为了解惠州地区鸡白痢和鸡伤寒沙门菌病的发生与流行现状,为本病的防治提供依据,采用平板凝集试验对惠州地区的部分禽群进行鸡白痢和鸡伤寒沙门菌病血清学调查。结果显示,惠州地区鸡白痢和鸡伤寒沙门菌病抗体阳性率为8.30%,惠州地区不同养殖模式鸡群、不同县(区)(仲恺区除外)鸡群、不同日龄鸡群、不同用途鸡群,种禽场不同性别禽群均有不同程度感染鸡白痢和鸡伤寒沙门菌病,说明惠州地区的鸡群受鸡白痢和鸡伤寒沙门菌病感染的情况普遍存在,相关部门应该切实加强对该病的防制与净化工作。

鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析

采用抑制性消减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析。结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段。经同源分析,这些序列可分为3类:噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列。这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素I、paJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因。结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株基因组间存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础。

鸡白痢/禽伤寒沙门菌抗体检测试剂的比较与评估

对市面上现有鸡白痢／禽伤寒沙门菌抗体平板凝集检测试剂及其不同批次，微量凝集检测试剂和ELISA共4种检测试剂进行比较与评估。用4种试剂以及试剂A的不同批次检测来自11个种鸡场的1650份血清，计算不同试剂检测种鸡场的抗体阳性率，2种试剂之间的阳性符合率、阴性符合率和总符合率，并以Kappa检验判断不同检测方法及其试剂之间的一致性程度。平板凝集试剂A的不同批次间以及平板凝集试剂A和B之间具有高度一致性（Kappa系数-0．714～0．746），但阳性符合率不足80％。平板凝集试剂A、微量凝集试剂C、ELISA试剂D之间仅具有中度或弱一致性（Kappa系数-0．392～0．542）。不同鸡白痢／禽伤寒沙门菌抗体检测试剂间存在差异，平板凝集试剂不同批次间也存在差异，提示试剂生产厂家应加强质量控制，同时研发敏感性、特异性、稳定性更好的替代试剂，而种鸡场在进行抗体监测时应固定使用1种检测试剂，避免影响检测结果的准确性和连续性。

实时荧光PCR技术在沙门菌种间鉴别中的应用

目的探讨用实时荧光PCR对沙门菌进行种间鉴别。方法根据猪霍乱沙门菌(Salmonella Choleraesuis,SC)和丙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi C,SP)的共有序列(Gen Bank:AE017220.1),伤寒沙门菌(Salmonella Typhi,ST;Gen Bank:NC_016832.1)和鸡伤寒沙门菌(Salmonella Gallinarum,SG;Gen Bank:HQ703462)的特异序列分别设计SCP、STP、SGP引物和Taq Man探针,在探针的5'端分别标记FAM、HEX、TET,建立基于Taq Man探针多重荧光PCR检测方法。同时,根据SC和SP差异序列(Gen Bank:CP000857)设计SPP引物和探针,在探针的5'端标记ROX,区分SC和SP。结果 SCP特异性扩增出25株SC和22株SP,STP和SGP分别扩增出31株ST和34株SG,而其他不同血清型沙门菌和非沙门菌扩增结果阴性。SPP扩增出22株SP,25株SC扩增结果阴性。扩增体系评价结果,SCP、STP、SGP和SPP扩增效率均在80%~100%,线性相关系数r2≥0.994。结论建立的方法特异性强、敏感性高,可用于SC、SP、ST、SG的种间鉴别。

SG97A平衡致死系统的构建及其初步应用

敲除鸡伤寒沙门菌(SG)减毒疫苗株97Aasd基因,构建宿主载体平衡致死系统并表达新城疫病毒(NDV)F蛋白,构建二价活菌苗。PCR扩增两段位于asd基因外侧的序列作为等位基因,以氯霉素抗性(CmR)基因替代asd基因,构建自杀质粒pGMB151Δasd::CmR,通过E.coliχ7213与SG97A固相杂交,将质粒转入SG97A,反向筛选获得SG97AΔasd::CmR,利用质粒pCP20去除CmR后,DAP的依赖菌株命名为SG97AΔasd。将含asd基因的质粒pYA3334转入SG97AΔasd中构建宿主载体平衡致死系统,并表达NDV-F蛋白。结果表明,通过等位基因重组方法,成功构建SG97AΔasd及宿主载体平衡致死系统,重组菌能够表达NDV-F蛋白,并能在鸡体内诱导产生特异性抗体。本研究成功构建SG97AΔasd宿主载体平衡致死系统,并表达NDV-F蛋白及其诱导宿主产生抗体,为应用该系统构建二价活菌苗的研究奠定了基础。