七彩山鸡内源性禽白血病病毒的鉴定及其env基因序列分析

为了解七彩山鸡感染内源性禽白血病病毒(ALV)情况,从上海某七彩山鸡场采集200份血浆样品,经DF1细胞分离和ALV p27抗原ELISA方法检测出13份阳性样品。将含有阳性样品的第一代细胞裂解液及细胞上清液同时盲传接种至第2代细胞,培养9 d后,p27抗原均未被检测到。对ALV p27抗原阳性细胞培养物进行env基因的扩增,最终得到了1株内源性ALV前病毒序列,其基因序列与已知的禽白血病病毒同源性为39.1%~66.7%。以上结果表明,该七彩山鸡品系中存在内源性禽白血病病毒感染。

与鸡内皮血管瘤病例相关的禽白血病病毒K亚群分离及其gp85基因演化分析

本研究在华南地区某规模化种禽场调查中发现其部分花鸡品系头部鸡冠下缘及眼睑上缘部位出现白色、质地坚硬且形状不规则的肿块,为了解患病鸡的发病特征及致病因子而开展了实验室诊断及相关病原研究。结果表明该规模化养殖场主要发病鸡群为父母代花鸡,发病率约为2%,剖检无其他肉眼表观病变,病理组织学诊断为内皮血管瘤。RT-PCR检测肿瘤组织表明为K亚群禽白血病病毒(ALV-K)感染,无其他禽肿瘤性病毒感染。对患病鸡的血浆样品(32份)、肿瘤组织匀浆(6份)及脑组织匀浆(6份)进行病毒的分离鉴定,成功从脑组织样品中分离到4个ALV-K毒株(GXJL01~GXJL04)。使用特异性引物扩增GXJL01~GXJL04的env基因并测序,在与华南地区其他5个规模化种禽场中分离获得的7个ALV-K流行株的gp85基因的遗传演化分析中表明,GXJL01~GXJL04与日本的Km5844、Sp53等神经胶质瘤毒株(fowl glioma-inducing virus, FGV)及具有神经组织嗜性的ALV-K毒株JS15SG01同一进化分支上,与本研究其他7个ALV-K分离株的遗传进化关系较远。同时在针对ALV-K的gp85蛋白氨基酸位点突变分析中发现,GXJL01~GXJL04存在多个与FGV和JS15SG01参考株相似的氨基酸位点突变。本研究首次把地方黄羽鸡品种花鸡头部的肿块诊断为内皮血管瘤,且ALV-K为内皮血管瘤的主要相关病原,分离株GXJL01~GXJL04区别于现行华南地区ALV-K流行株且与FGV、JS15SG01等神经组织嗜性的毒株高度同源。

禽内源白血病病毒ev3、ev6和ev21对雏鸡免疫器官指数和血清指标的影响

试验旨在探究禽内源性白血病病毒ev3、ev6和ev21对雏鸡免疫性能的影响。试验利用PCR技术检测太行鸡、大午金凤雏鸡的羽型和ev3、ev6、ev21整合性,测定雏鸡的体重、免疫器官指数,利用ELISA技术检测雏鸡血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、白细胞介素4(IL-4)和白细胞介素10(IL-10)含量。结果显示,ev3在太行鸡的整合阳性率显著高于大午金凤鸡(P<0.05)。ev3整合阳性太行鸡的法氏囊指数显著高于阴性个体(P<0.05),体重显著低于阴性个体(P<0.05)。ev21阴性太行鸡体重显著高于阳性鸡(P<0.05)。太行鸡母鸡体重和免疫器官总重显著高于公鸡(P<0.05)。ev3阳性太行鸡血清IgG和IL-4含量显著高于ev3阴性鸡(P<0.05)。ev6阳性太行鸡血清IL-10含量显著低于ev6阴性鸡(P<0.05)。ev3阳性大午金凤鸡血清IgM含量显著低于ev3阴性鸡(P<0.05)。ev21阳性慢羽大午金凤公鸡血清IL-4含量显著高于ev21阴性快羽母鸡(P<0.05)。太行慢羽鸡和母鸡的血清IgG含量显著高于快羽鸡和公鸡(P<0.05)。ev21阴性太行快羽鸡血清IgG含量显著低于ev21阴性太行慢羽鸡和ev21阳性太行慢羽鸡(P<0.05)。研究表明,ev3整合提高了1日龄太行鸡的免疫性能,降低了其体重和大午金凤鸡血清IgM含量;ev6整合降低了太行鸡血清IL-10含量;ev21整合降低了1日龄太行鸡的体重,提高了大午金凤鸡血清IL-4含量。

鸡内源性类J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆及分析

为深入探讨J亚群禽白血病病毒(AvianleukosisvirussubgroupJ,ALV J)的亚群特性,利用ALV Jgp85基因两侧的序列片段为引物,从正常SPF蛋鸡、商品肉鸡和DF1细胞基因组中完整地扩增了内源性类ALV Jgp85基因。肉鸡和DF1细胞内源性类ALV Jgp85基因同源性达99 9%;SPF蛋鸡内源性类ALV Jgp85基因与肉鸡和DF1细胞的内源性类ALV Jgp85基因之间同源性达95 6%、95 3%。三种不同来源的内源性类ALV Jgp85基因DNA与IMC10200株ALV J的gp85基因的同源性分别为91 8%、94 1%、94 0%;与ALV J原型株HPRS 103gp85基因的同源性分别为95 6%、98 3%、99 9%。内源性类ALV Jgp85序列与外源性ALV Jgp85基因具有相似或一致的ORF和Jameson Worlf抗原表位优势。

麻黄肉种鸡蛋清中内源性禽白血病病毒的分离与遗传鉴定

为了解麻黄肉种鸡蛋清中内源性禽白血病病毒(内源性ALV)的分布情况,从广东某麻黄肉种鸡场采集1 038份蛋清,经ALV p27抗原ELISA检测出30份阳性蛋清;将阳性蛋清同时接种DF1和CEF细胞,培养7 d后,p27抗原ELI-SA检测到13份样品为DF1-CEF+;以这13份CEF+细胞培养物的基因组DNA为模板,经PCR扩增克隆测序最终得到了1株内源性ALV前病毒序列。将经ELISA、PCR和IFA等方法鉴定的该内源性ALV命名为HN1301株。基于遗传分析表明,HN1301株的前病毒基因序列与已知的E亚群毒株ev1、SD0501的相似性均为99.4%。表明该麻黄肉种鸡品系中存在有复制能力的内源性ALV,因而易干扰基于p27抗原的ELISA检测;本研究对于麻黄肉种鸡禽白血病的防控与净化有参考价值。

长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与禽白血病病毒抗性和易感品系鸡相关性分析

内源性反转录病毒是长非编码RNA的重要来源,在抗病毒先天性免疫中发挥重要作用。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1能够激活细胞免疫功能并抑制禽白血病病毒增殖。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性和易感品系鸡中的表达规律及其与禽白血病病毒抗性的相关性,本研究通过荧光定量PCR发现,lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性(G1)品系鸡免疫器官(胸腺、脾脏和法氏囊)和CEF细胞中的表达水平显著高于ALV易感(G3)品系鸡。病毒感染实验表明lnc-ALVE1-AS1在ALVJ感染CEF(G1和G3来源)细胞24h和96h后均显著下调;但是,lnc-ALVE1-AS1在G3来源CEF细胞中的表达水平下降更为明显,且ALVJ病毒复制水平显著高于G1鸡来源的CEF细胞。进一步通过lnc-ALVE1-AS1过表达实验证实,lnc-ALVE1-AS1不仅可以显著上调G3来源CEF细胞dsRNA识别受体(TLR3和IFIH1)和抗病毒天然免疫基因(IFI27-L2、IFIT5、IFITM3、IFN-β、ISG12-2和RASD2)表达,还显著抑制ALVJ复制。本研究揭示了lnc-ALVE1-AS1在禽白血病病毒抗性和易感品系鸡细胞和免疫组织器官中的表达规律和抗病毒功能,为抗病育种研究提供了新的遗传基础。

湖北省鸡群内源性禽白血病病毒分子特征研究

为了解内源性禽白血病病毒在我国鸡群中的存在状况,利用特异性引物对湖北省鸡群—江汉鸡和灵山麻鸡的鸡胚中内源性禽白血病病毒进行了PCR检测。结果显示,所有的鸡胚中均检测出内源性禽白血病病毒EAV、ev、ev/J和ART-CH基因序列。进化树分析发现,相对于内源性病毒原型株E51,江汉鸡的EAV基因组更加接近于原型株EAV-0;江汉鸡和灵山麻鸡的ART-CH核苷酸序列之间相似度很高,但与已知的ART-CH5和ART-CH14核苷酸序列存在较大差异;尽管江汉鸡和灵山麻鸡的ev和ev/J核苷酸与其他已知的ev和ev/J的相关序列差异较小,但其在系统进化树上仍属于不同的分支。该结果说明江汉鸡和灵山麻鸡的内源性病毒基因的进化路径与其他已知的内源性病毒基因的进化路径不同。

鸡羽速基因与內源禽白血病病毒的关系及其在育种中的应用

家禽生产中常用伴性遗传的羽速基因(K/k+)来建立自别雌雄品系。但是,慢羽型鸡,特别是白来航鸡,常被发现在生活力和抗病力方面与快羽型鸡相比存在劣势。本文阐述了慢羽基因K与ev21等禽内源性病毒以及生产性能和抗病力的关系,总结了可能提高慢羽蛋鸡品系抗病力的育种策略及其在生产中的应用。

鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒的研制

用特定引物通过PCR合成了经地高辛标记的鸡致病性外源性及内源性禽白血病病毒特异性核酸探针,通过交叉斑点分子杂交,这些探针将可用于检测病料样品中致病性外源性禽白血病毒特异性核酸的存在。利用此试剂盒,对从病料组织样品中提取的基因组DNA作交叉斑点分子杂交或对提取的DNA用相应引物扩增后的PCR产物作交叉斑点分子杂交,可在24～36 h内完成检测并报告结果。

内源性禽白血病病毒ev/J基因克隆与分析

用位于内源性禽白血病病毒ev/J 5′和3′长末端序列(LTR)上的引物,对我国的灵山麻鸡、江汉鸡、肉鸡和SPF鸡正常基因组中内源性ev/J进行扩增,结果扩增出长约为4 kb、2.2 kb和2 kb 3种大小的片段。测序分析表明,这些片段分属于Ⅱ型和Ⅳ型ev/J以及另一类具有更大缺失的ev/J基因。ev/J在这几个品系鸡中分布并不完全相同,肉鸡和SPF鸡均具有Ⅱ型和Ⅳ型ev/J,江汉鸡只含Ⅱ型ev/J,而灵山麻鸡则含有另一类具有更大缺失的ev/J基因。此次获得的Ⅳ型ev/J序列不仅相互之间高度同源,而且其env基因与外源性ALV-J原型株HPRS-103env基因以及我国外源性ALV-J主要分离株env基因也高度同源,表明内源性ev/J在宿主正常基因组中高度保守。

海兰鸡内源性白血病病毒位点序列鉴定与分析

鉴定和比较海兰鸡基因组中内源性禽白血病病毒(ALV)位点。使用超嗜热古菌Thermococcus sp.4557来源重组表达的Pol B DNA聚合酶,通过一次PCR反应从海兰鸡的基因组DNA中扩增到了包括gag、pol、env基因部分片段及3′-LTR的内源性ALV位点,将其命名为HL-E1。序列比较表明,其env基因与E亚群内源性ALV高度同源;与完整的ALV基因组相比,其gag、pol、env三个主要功能基因分别缺失了93、1 960和805个碱基。海兰鸡基因组中存在4 663bp的缺陷型ALV基因组片段,其env基因和LTR都与鸡基因组上经典的ev1位点的相应基因有96.8%和97.4%的相似性,表明这是整合进海兰鸡染色体基因组中的一个内源性E亚群ALV片段构成的ev位点,这是又一个ev位点的全序列报道。

鸡内源性白血病毒ev21与其侧翼区SNP位点的连锁关系

鸡内源逆转录病毒ev21的转录表达影响宿主机体健康。本试验通过PCR检测海兰褐、太行鸡、海兰灰和SPF鸡292份DNA样品的ev21阴阳性、羽型和性别,测序筛选ev21插入位点OS和US区的SNP位点,Mbo II酶切检测C>T突变的群体多样性,分析C>T突变与ev21整合的连锁关系;最后利用TRANSFAC®Professional预测C>T突变引起的转录因子变化。测序峰图发现,ev21插入位点上游278 bp处的C>T突变。OS和US共有610 bp酶切结果发现,快羽ev21阴性鸡为CC基因型,快羽ev21阳性鸡为CT基因型;慢羽除海兰灰和海兰褐祖代ev21阳性鸡为TT基因型外,其他均为CT基因型。OS特异1036 bp酶切显示ev21整合的OS区全部为T单倍型,C>T突变造成转录因子结合变化。研究表明ev21整合的OS区和未整合的US区的C>T突变有5种单倍型,ev21整合与T等位基因连锁。

慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因敲除

【目的】探索在慢羽鸡成纤维细胞中敲除ev21基因的可行性,净化鸡群内源性逆转录病毒,同时为快速培育缺失ev21基因的慢羽鸡配套系打下基础。【方法】根据ev21基因序列(KY235336)特点,分别在其5’和3’端各设计2个sgRNA,用于构建4种不同sgRNA的打靶质粒,筛选出在5’和3’端打靶效率较高的sgRNA。然后基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对ev21基因进行剪切,并通过同源重组方式以红色荧光蛋白(mCherry)的DNA片段(CAG-mCherry)替换ev21基因,实现对慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因定点敲除。【结果】在慢羽鸡成纤维细胞中能检测到ev21基因,构建的4种sgRNA(sgRNA1~sgRNA4)均能成功插入对应的打靶质粒中,经嘌呤霉素筛选及T7E1酶切检测,发现转染4种不同sgRNA打靶质粒后慢羽鸡成纤维细胞均有不同程度的死亡,其中又以sgRNA1和sgRNA3的基因敲除效率较高。同时针对同源位点左右同源臂构建表达mCherry的供体质粒,以其转染293T细胞12 h后均能表达出mCherry。以sgRNA1和sgRNA3打靶质粒及供体质粒共同转染慢羽鸡成纤维细胞,观察发现成纤维细胞内的mCherry持续表达,至转染后第30 d通过流式细胞仪分选收集红色荧光阳性成纤维细胞,并提取其总DNA进行PCR鉴定与基因测序,结果显示红色荧光阳性成纤维细胞中有目的片段(CAG-mCherry)插入,即以插入替换方式能实现对ev21基因的敲除。【结论】基于crispr/cas9基因编辑技术的基因敲除方法能成功敲除慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因,为培育缺失ev21基因的慢羽鸡品系提供技术支持。

鸡感染J亚群禽白血病病毒的免疫抑制机理

通过人工接种建立了雏鸡感染J亚群禽白血病病毒(ALV-J)后发生免疫抑制的病理模型,对免疫抑制的机理进行了初步研究。结果表明:ALV-J感染早期可诱导胸腺、法氏囊的淋巴细胞凋亡,这种早期的淋巴细胞凋亡是胸腺和法氏囊萎缩的重要原因之一。病理组织学动态观察表明,ALV-J主要引起骨髓的髓系细胞灶状或弥漫性增生,病变导致骨髓机能受损,使机体免疫机能下降,是引起免疫抑制的根本原因。病毒感染组免疫器官均发生了严重的实质萎缩性病变,这种病变的发生除与骨髓的病变及淋巴细胞凋亡有关外,还与中后期淋巴细胞的坏死有关,从而导致严重的免疫抑制。ALV-J感染可引起免疫器官及部分内脏器官中嗜酸性粒细胞样的瘤细胞浸润增生,这可以作为病毒感染早期的病理诊断指标。

禽白血病诊断方法及净化研究进展

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引发的一种种源性传染性疾病。目前,我国防治此病的基本策略为种鸡分阶段检测及根除净化。自我国实施净化方案以来已在部分品种鸡中获得可观成效,但部分地方品种鸡感染发病率仍较高。本综述主要概述了AL主要病原特性、诊断方法和净化防控现状的研究进展,旨在为ALV检测净化提供有价值的参考。

广西麻鸡感染A亚群与J亚群禽白血病病毒的诊断

对疑似患有禽白血病的广西麻鸡进行病理剖检、接种DF-1细胞进行病毒分离以及对细胞培养上清进行p27抗原检测、细胞培养物进行PCR扩增,并对分离到病毒的gp85基因进行测序和分析比较。结果表明,从该病鸡同时分离到了A亚群禽白血病病毒（ALV-A）与J亚群禽白血病病毒（ALV-J）,分别命名为ZS14-A株、ZS14-J株。对ALV-A gp85、ALV-J gp85基因的遗传变异分析结果显示,ZS14-A与6株国内外A亚群参考毒株之间的氨基酸同源性为86.3%~87.8%,其中与国外株MAV-1同源性最高,为87.8%。ZS14-J与7株国内外J亚群参考毒株之间的氨基酸同源性为83.4%~96.1%,其中与J亚群原型株HPRS103同源性最高,为96.1%。

珍珠鸡白血病防控

1珍珠鸡白血病的危害鸡白血病是由禽白血病病毒引起的一种病毒性疾病,该病珍珠鸡感染后死亡率通常较高,尤其是雏鸡和青年鸡。病鸡生长发育和生产性能受影响,其体重减轻、羽毛生长缓慢、产蛋量下降,免疫系统受损,抵抗力下降,容易感染其他疾病。病毒具有高度传染性,可以通过直接接触、飞沫传播等方式在珍珠鸡群中快速传播。

山东五大地方鸡禽白血病病毒主要流行亚型鉴定及其分离株gp85基因的分子特征分析

通过对山东五大地方鸡(寿光鸡、芦花鸡、百日鸡、琅琊鸡、鲁西斗鸡)不同亚型禽白血病病毒(ALV)分离株鉴定及gp85基因序列分析,探究山东五大地方鸡ALV的主要流行亚型及gp85基因分子特征。分别将寿光鸡、百日鸡、芦花鸡的无菌抗凝血和琅琊鸡、鲁西斗鸡的卵白接种CEF培养9~10d,常规方法提取感染细胞的cDNA,用针对J亚型ALV(ALV-J)gp85基因(924bp)的引物和A^J(含囊膜蛋白env基因,2 400bp)的群引物进行PCR扩增、克隆、测序并分析其特点。本研究发现,2009—2011年间,山东五大地方鸡均存在ALV-J感染,5个ALV-J分离株gp85基因之间的相似性为98.4%~99.9%,与原型毒株HPRS-103相似性为97.8%~98.3%;均扩出内源性ALV(ALV-E)片段,与不能产生传染性病毒粒子的ev-1、ev-3、ev-6毒株相似性最高,推测为鸡基因组所携带;同时还发现,琅琊鸡、芦花鸡存在A亚型ALV(ALV-A)的感染。研究结果表明,2009—2011年间的山东五大地方鸡已经普遍存在ALV-J,两大品系中存在ALV-A和ALV-J共感染,同时ALV-E的片段广泛存在,这一结论揭示出山东地方鸡的禽白血病净化工作更加具有挑战性。

地方鸡种禽白血病病毒感染动态及检测方法比较

为了解我国地方鸡种禽白血病病毒自然感染动态,掌握其育雏及育成期带毒、排毒规律和检测敏感期,试验应用ELISA试剂盒检测泄殖腔拭子p27抗原和血浆病毒分离的方法,对来自保种群的1日龄胎粪p27抗原检测为阳性的绿壳蛋鸡,与同栏饲养在隔离环境中的阴性全同胞,分别于1、3、5、7、9、11周龄进行采样跟踪检测。结果显示,该鸡群检测期内全程带毒、排毒。其中,泄殖腔拭子p27抗原检出率在5周龄达到最高峰,为67.7%;而血浆病毒分离对全群检出最高峰为9周龄,达25.8%,对公鸡和母鸡检出最高峰分别为11和9周龄,净化过程中可以此作为检测敏感期;各检测时间点,泄殖腔拭子p27抗原阳性率普遍高于血浆病毒分离率,二者符合率最高为65.0%,表明对我国地方鸡种实施禽白血病净化,泄殖腔拭子p27抗原检测不能完全取代病毒分离检测,多种方法联合运用意义重大。试验结果为快速、有效开展地方鸡种外源性禽白血病的检测与净化提供了可靠依据。

江西地方品种鸡禽白血病病毒及鸡白痢沙门氏菌感染状况的研究

禽白血病毒(ALV)和鸡白痢沙门氏菌(SP)均可以垂直传播。通过禽白血病病毒(ALV)J亚群抗体和群特异性P27抗原的商品化ELISA检测试剂盒和全血平板法等调查了江西省13个种鸡企业的8个地方品种鸡群ALV和SP的感染情况,结果显示:ALV-P27抗原、ALV-J抗体均有检出,江西省地方鸡ALV-J亚型感染相当严重,迫切需要净化。江西地方品种鸡白痢沙门氏菌感染率相差较大,同一品种鸡在不同场之间的SP感染率差异明显。生物安全措施会影响鸡白痢的感染情况,在鸡白痢的净化过程中,采取严格的淘汰制度的同时,必须加强饲养管理措施来控制鸡白痢的发生。