鸡减蛋综合征病毒(Egg Drop Syndrome Virus,EDSV)巯基内肽酶的基因序列分析

鸡减蛋综合征病毒（ＥｇｇＤｒｏｐＳｙｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓ，ＥＤＳＶ）巯基内肽酶的基因序列分析曾力宇１金奇１朱雷１章金钢２殷震２侯云德１关键词鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ），巯基内肽酶（Ｔｈｉｏｌ－ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ），核苷酸序列分析ＥＤＳ病毒...

鸡减蛋综合征病毒(EDSV-76)末端前体蛋白的基因结构分析

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒弱毒株ＡＡ－２，经常规方法提取其病毒核酸后，组建了完整的限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库，并对其中ＨｉｎｄⅢ（２１．０ｍ．ｕ．）－ＳａｃⅠ（３３．２ｕ．）进行了序列测定。同源比较分析证明：其Ｌ链含编码病毒末端前体蛋白，容量为５８０个氨基酸残基（ａａ）的开放读码框架（Ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）。由此推导的多肽氨基酸序列及结构特点，如保守序列、核定位信号（Ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）。等与其他腺病毒的相应多肽存在较大差异。本文为阐明腺病毒末端前体蛋白参与ＤＮＡ复制起始的机制提供了新的依据。

鸡减蛋综合征病毒(EDSV)主要蛋白的结构分析

鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）中国株ＡＡ－２基因组全长为３２８３８ｂｐ，其编码病毒主要结构蛋白（５２／５５Ｋ、Ⅲａ、五邻体、ｐＶⅡ、ｐＶⅠ、六邻体、１００ｋ、ｐＶⅢ以及纤维蛋白等）的基因依次排列在基因组的中部，Ｅ２区编码ＤＮＡ结合蛋白、ＤＮＡ多聚酶、末端前体蛋白及ＩＶａⅡ的基因也分别排列在ＥＤＳＶ基因组的负链上。对这些蛋白的氨基酸序列进行同源性比较后发现，ＥＤＳＶ的主要蛋白与羊腺病毒（ＯＡＶ）同类物存在不同寻常的高同源性。

鸡减蛋综合征病毒(EDSV)基因组右末端结构的分析

从中国发病鸡中分离的鸡减蛋综合征病毒（ＥｇｇＤｒｏｐＳｙｎｄｒｏｍＶｉｒｕｓ，ＥＤＳＶ）弱毒株（ＡＡ－２），其基因组全长约为３３ｋｂ。用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ水解ＥＤＳＶ全基因组，构建了以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡ（ＫＳ＋）为载体的右末端片段的克隆（约４．２ｋｂ），对其进行了序列测定和结构分析。该片段全长４１８３个碱基对（ｂｐ），位于基因组右末端８７．３ｍ．ｕ．－１００ｍ．ｕ．。结果显示，该片段与哺乳动物腺病毒右末端Ｅ４区结构不同，与禽Ⅰ型腺病毒代表株ＣＥＬＯ右末端片段亦无同源性。本文为深入了解ＥＤＳＶ基因组结构特点。

鸡减蛋综合征病毒EDSV-HX株的分离鉴定与免疫原性评价

为研究某发病鸡群病料中所分离病毒的遗传特性、致病性及免疫原性,通过流行病学、基因序列测定、血凝和血凝抑制试验,确定所分离的病毒为鸡减蛋综合征病毒(EDSV),并命名为EDSV-HX株。随后制备该毒株的油乳剂灭活疫苗,分别以不同剂量免疫蛋鸡,并根据HI抗体效价将免疫蛋鸡重新分为不同的抗体水平组进行攻毒试验。结果显示:当免疫鸡HI抗体效价不低于7log2时,可为免疫蛋鸡提供有效攻毒保护,且产蛋不受影响。研究表明EDSV-HX株具有高致病性和良好的免疫原性,可作为效力检验用毒及灭活疫苗的候选株。

鲁、豫两省鸡减蛋综合征(EDS—76)血清学调查

编者按:鸡减产综合征自1976年以来,已在许多国家和地区流行,我国台湾省已有发病报道,广东省对24个种鸡场进行调查,就有6个场检查血清学为阳性。本文报道了鲁、豫两省部分鸡场的检疫结果。14个鸡场中有6个检出抗体,个别鸡场阳性率达25%,这足以引起养禽界的高度重视,及早作好预防准备。

减蛋综合征中药佐剂灭活苗研究 Ⅳ.EDs中药灭活苗田间免疫试验

用研制的四批EDS中药佐剂灭活苗(9301、9302、9401、9402)先后在滨州市、邹平和桓台县的三个鸡场和20余个养鸡专业户进行了田间免疫试验,共预防免疫伊沙、罗曼、迪卡、海塞克斯红羽商品蛋鸡5万余只。

鸡新城疫(ND)—产蛋下降综合征(EDS76)二联灭活疫苗研制Ⅰ、ND—EDS76二联灭活苗的安全性和免疫性试验

用 ND LaSota 株病毒和 EDS76K—11株病毒分别接种鸡胚和鸭胚,制备抗原液,经甲醛溶液灭活后与油相佐剂乳化,制出二联灭活疫苗3批。对制品的安全性和免疫性进行了测定,对3—6周龄易感雏鸡以2倍使用剂量肌肉注射,安全性良好;对1日龄雏鸡接种1个使用剂量,进行急性毒性试验观测,15天生长曲线表明,对雏鸡没有影响;对3—6周龄雏鸡注射1个使用剂量,每批制品注射10只鸡,免疫后鸡血消中 EDS76血凝抑制(HI)抗体的几何平均滴度(GMT)分别为1:363、1:224和1:575;对鸡新城疫免疫攻击试验表明,3批制品每羽份含有的 PD_(50)分别为≥111、≥131和≥1:127。

减蛋综合征中药佐剂灭活苗的研究——Ⅱ.EDS中药佐剂灭活苗保存期与免疫期试验

对研制的三批中药佐剂灭活苗,在室内进行了保存期及免疫期试验。

鸡减蛋综合征病毒SD-YS株的分离鉴定和免疫原性研究

为了解蛋鸡群中鸡减蛋综合征病毒(egg drop syndrome virus,EDSV)的流行特点,筛选免疫原性良好的疫苗毒株,将山东潍坊市某养鸡场疑似EDSV感染鸡的输卵管组织进行病毒分离,对分离毒株进行血清学特异性鉴定、PCR鉴定和攻毒试验。病毒分离培养结果显示:分离株SD-YS可在易感鸭胚中增殖,血凝效价为2^(15)~2^(18),病毒含量为10^(7.7) EID50/0.1 mL。交叉血凝抑制试验结果显示:分离病毒液呈EDSV阳性。PCR鉴定结果显示:分离株SD-YS可扩增出长约2000 bp的特异性目的条带,与标准株AV127株和6株EDSV参考毒株的序列98.9%~99.4%同源。攻毒试验结果显示:SPF鸡免疫由SD-YS株制备的灭活疫苗(0.2 mL/羽)后,可获得良好的HI抗体(8.9log2),当HI抗体效价≥7log2时,免疫鸡可获得有效的攻毒保护。结果表明,分离毒株SD-YS为EDSV,具有良好免疫原性,可作为EDSV灭活疫苗的候选毒株。

新城疫(ND)-减蛋综合征(EDS76)蜂胶二联灭活疫苗的研制Ⅰ.制苗工艺、疫苗安全性和免疫原性试验

将新城疫病毒 ( NDV) Colon-30株和减蛋综合征病毒 ( EDS76AV) -1 2 7株分别接种于非免疫鸡胚和鸭胚 ,制备抗原液。抗原液经甲醛灭活后 ,与纯化的天然免疫增强剂蜂胶乳化 ,制成鸡新城疫 ( ND) -减蛋综合征( EDS76)蜂胶二联灭活疫苗 ,对疫苗的安全性和免疫原性进行了测定。对 3～ 6周龄易感雏鸡以 2倍使用剂量肌肉注射 ,安全性良好 ;对 1日龄雏鸡接种 1个使用剂量进行急性毒性试验 ,1 5d生长曲线表明 ,对雏鸡无影响 ;对 6周龄雏鸡注射 1个使用剂量 ,每批疫苗免疫 1 0只鸡 ,免疫后 5～ 32 d,鸡血清中 EDS76血凝抑制( HI)抗体的几何平均滴度 ( GMT)为 6.5～ 1 1 .8log2 ,ND血凝抑制 ( HI)抗体的几何平均滴度 ( GMT)为 4 .8～ 9.8log2 ;对 ND免疫攻毒试验表明 ,3批疫苗 ,每羽份含有的半数保护量 ( PD5 0 )分别为≥ 1 2 7、≥ 1 31和≥1 2 7。

鸡减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因的序列分析

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ），经非免疫鸭胚增殖后，用差速离心法纯化和蛋白酶Ｋ法抽提，获得全长约为３４ｋｂ的ＥＤＳＶ全基因组。用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ酶解ＥＤＳＶ全基因，以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡ为载体，构建了ＥＤＳＶ的ＨｉｎｄⅢ酶解片段的文库，并对其中的Ｄ片段（长为３．６ｋｂ）进行了序列测定及同源分析，结果提示该片段中唯一一个完整的开放读码框架（ＯＲＦ）（４３０～３１６２位）编码ＥＤＳＶ的六邻体蛋白，其特定氨基酸残基的排列组合和功能区的分布等与其他几个具有代表性的腺病毒的六邻体蛋白相似，它们之间的核苷酸序列同源性在４９．６％～７２．９％，氨基酸序列同源性在４６．３％～８３．９％。本研究为进一步阐明ＥＤＳＶ基因组的结构特点。

银加强胶体金探针检测鸡减蛋综合征病毒的研究

本研究首次报道应用银加强胶体金探针检测鸡减蛋综合征（ＥＤＳ７６）病毒获得成功。经初步提纯后的ＥＤＳ７６病毒免疫兔制备高免血清，按常规方法提取兔抗ＥＤＳ７６病毒的ＩｇＧ，成功地建立了检测ＥＤＳ７６病毒抗原的银加强胶体金探针法（ＳＥＣＧＰＡ），并确定了操作程序的最佳试验条件为：兔抗ＥＤＳＶＩｇＧ工作浓度为１４００，金标记羊抗兔ＩｇＧ的工作浓度为１２０，银染色的时间为１５ｍｉｎ。用该法对提纯的ＥＤＳ７６病毒（ＥＤＳＶ）抗原的最低检出量为０．１１７１９μｇ／ｍｌ。以此法检测了人工感染的５０只鸡采集的样本，对卵巢、输卵管峡部、咽喉部、软壳蛋的阳性率均为１００％，粪便阳性率为９２％，而检测鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等鸡源病毒和细菌样品时全部呈阴性反应。研究结果表明，该法具有快速、准确、操作简便、敏感性高、易于判读、特异性强、重复性好等优点。

鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性脑脊髓炎四联油佐剂灭活疫苗的研究

用NDV La Sota株、IBV M41株、EDS76 V HSH23株、AEV Van Roekel株为种毒,分别接种鸡胚或鸭胚,制备各种病毒抗原液,经福尔马林灭活后,采用FILTRON盒式超滤系统对制苗病毒抗原液进行浓缩,然后按一定比例混合,以司本80及吐温80为乳化剂,10号白油为佐剂,制成ND-IB-EDS76-AE四联灭活疫苗。对四联苗各项技术指标进行了测定,证明本疫苗安全、无任何副作用;免疫10-14 d后产生免疫力;ND部分效检,攻毒100％保护,每羽份含ND效价达50-123 PD50;IB部分效检,免疫21-28 d后攻毒保护率达80％-100％,IB HI效价≥1:64;EDS76效检,免疫后21 d HI效价≥1:128;AE效检,保护率达80％-100％。

不同免疫增效剂对鸡减蛋综合征免疫效果的影响

为了验证不同免疫增效剂对鸡减蛋综合征(EDS76)免疫效果的影响,试验以鸡减蛋综合征抗体效价为指示,比较不同免疫增效剂的免疫效果。每只鸡皮下注射EDS76灭活油乳剂疫苗,再将试验鸡随机分成4个试验组和1个对照组,试验组分别给予鸡转移因子、黄芪、左旋咪唑、灵芝粉4种药品,对照组给予等量的生理盐水。在免疫后的1,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24天分别采血,采用血凝抑制试验(HI)测定EDS76抗体效价。结果表明:鸡转移因子组在第14天时抗体效价出现极显著差异,且一直保持增长趋势;黄芪组在第18天时抗体效价出现极显著差异,且一直保持高水平状态;左旋咪唑组只在第20天时抗体效价出现显著变化;灵芝粉组在第12天时抗体效价出现显著变化,并一直保持高水平状态。说明鸡转移因子的增效作用最强可优先使用,黄芪和灵芝粉次之,左旋咪唑酌情使用。

胶体金快速诊断方法对鸡减蛋综合征病毒的检测

选择15 nm的胶体金颗粒作为标记物,制备了鸡减蛋综合征病毒(EDSV)胶体金试纸条。该试纸条能检出浓度约为1.35μg/mL的纯化EDSV,用该试纸条检测135份临床样本,并与HA方法相比较,结果显示,二者的阳性符合率为89.8%。特异性试验结果显示,与鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应。表明,该试纸条用于检测EDSV具有快速、操作简便、特异性强等优点,可用于大批量抗原样本的检测。

鸡新城疫和减蛋综合征二联灭活苗的制备及其免疫效果观察

用鸡新城疫(ND)Lasota系N79克隆株和减蛋综合征(EDS-76)GC_2毒株,分别接种鸡胚和鸭胚,收获尿囊液毒,血凝价分别达1:2048和1:10000以上,用一定浓度福尔马林37℃作用16～18小时进行灭活,按一定比例混匀,加入7号白油油相中,制备三批二联油乳剂灭活苗,接种产蛋母鸡,接种后15天产生EDS-76 HI抗体,并在一个月内持续升高,而ND HI抗体产生时间略早,至接种后2～3周达到高峰,两者无干扰性;接种一个月后攻毒,对ND保护率4/4,对EDS-76保护性良好;实际应用时选择肌肉注射或皮下注射,0.5～1毫升/羽。

减蛋综合征-76病毒在鸡体内的动态分布及其与蛋传递的关系

用减蛋综合征-76(Egg drop syndrome’76)病毒WPDV205株感染31周龄莱航鸡,复制出了典型的减蛋综合征产蛋曲线,但蛋壳质量未见变化。从接种后第2周初,产蛋率由68.4％开始下降,至第4周降至43.5％。放射示踪实验表明,接种后7天,病毒分布于卵巢和输卵管的膨大部、峡部及阴道部,14天在肺和输卵管的膨大部,21天在阴道部,28天在肾和输卵管的漏斗部、峡部及阴道部。第4周后,除第8周在阴道部检出病毒外,在生殖道其它部位均未检出病毒。鸡群接种病毒后第1至4周从其蛋内容物中检测到病毒。

新型基因芯片检测禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡减蛋综合征病毒

建立了可同时筛选禽流感病毒(AIV)通用型、H4、H5、H6、H7、H9、N1、N2、N9亚型及鸡新城疫病毒(NDV)、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的基因芯片检测方法。从GenBank中下载相关序列,利用分子生物学软件设计特异性引物和杂交探针。使用Dr.chip系统进行芯片点样、杂交、显色、读数,优化反应条件后做灵敏度、特异性试验,然后应用于临床检验。结果显示,各病原间无交叉反应,探针可特异性识别靶基因;病原的最低浓度为4.83pg/μL,灵敏度较高;每个梯度的两个反应结果一致,重复性良好。对临床样品检验,结果同病毒分离鉴定方法一致。本研究建立的基因芯片检测方法可用于禽流感通用型、H4、H5、H6、H7、H9、N1、N2、N9亚型及NDV、EDSV的鉴别检测。

鸡减蛋综合征病毒DNA结合蛋白的基因结构及同源分析

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２株，经常规方法提取其病毒核酸后，构建了限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库。对其中ＨｉｎｄⅢ－Ｆ片段（５２．９～５８．９ｍｕ）的正反２条链的序列测定发现，其反链存在１个编码容量为３８７个氨基酸（ａａ）的开放读码框架（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），经Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＥＭＢＬ同源搜寻后证实其编码产物为ＥＤＳＶ的ＤＮＡ结合蛋白（ＤＢＰ）。与其他腺病毒ＤＢＰ的氨基酸序列进行同源比较，其Ｎ端同源性在１９．０％～４６．２％之间，Ｃ端同源性在２７．７％～６０．４％之间。腺病毒ＤＢＰ的３个保守序列ＣＲ１，ＣＲ２，ＣＲ３在ＥＤＳＶＤＢＰ中有较大变化，但ＥＤＳＶＤＢＰ的锌指框架（Ｚｎ２＋ｆｉｎｇｅｒｍｏｔｉｆ）却保留了对其功能必需的残基。