体外无血清培养的鸡卵泡细胞GnRH样肽分泌的研究

本实验通过12 5Ⅰ标记的鸡GnRH与同源血清 (抗体 )反应 ,建立了鸡GnRH放射免疫分析法 (RIA) ,并用以检测体外无血清培养的鸡卵泡细胞 ,证明卵泡膜细胞 (TC)和颗粒细胞 (GC)培养液中均存在GnRH Ⅱ样肽物质。并发现TC细胞培养液中的GnRH Ⅱ样肽含量在 72h内随培养时间加长而增多 ,而GC细胞培养液中GnRH样肽含量变化不明显。实验结果表明鸡卵泡细胞能产生GnRH

美洲大蠊小肽对鸡小黄卵泡外膜细胞增殖和血管生成的影响

为了探讨美洲大蠊小肽对鸡小黄卵泡外膜细胞增殖和血管生成的影响,试验用不同浓度的美洲大蠊小肽(400,800,1200μg/mL)处理体外培养的鸡小黄卵泡外膜细胞,以正常细胞作为空白对照,采用CCK-8法分别在0,12,24,48小时检测细胞活力,筛选最佳药物浓度和作用时间;用EdU法检测细胞增殖能力;用实时荧光定量PCR法和Western-blot法分别检测各组细胞中ANXA2、VEGF的mRNA及其蛋白质的表达量;通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验检测不同浓度美洲大蠊小肽对血管生成的作用。结果表明:与对照相比,美洲大蠊小肽能够提高鸡小黄卵泡外膜细胞的细胞活力,显著促进细胞增殖(P<0.05),最佳药物浓度及作用时间为800μg/mL、24 h。800μg/mL美洲大蠊小肽能够显著上调鸡小黄卵泡外膜细胞中ANXA2和VEGF的mRNA和蛋白质表达量(P<0.05)。不同浓度美洲大蠊小肽均具有显著的促血管生成作用,800μg/mL组效果最明显(P<0.05)。说明美洲大蠊小肽能显著促进鸡小黄卵泡外膜细胞增殖和血管生成,其可能是通过ANXA2和VEGF发挥调控作用的。

3-硝基丙酸对鸡等级卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响

鸡等级卵泡颗粒细胞培养24 h后,在培养基中加入10、5、2.5 mmol/L的3-硝基丙酸(3-NPA)继续培养24 h。利用活性氧(ROS)试剂盒检测细胞中ROS的含量;采用ELISA检测细胞上清中孕酮(P4)含量,并采用qRT-PCR技术检测类固醇生成急性调节蛋白(StAR)、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)及3β-类固醇脱氢酶(3β-HSD)mRNA的相对表达量,以检测3-NPA对颗粒细胞孕酮分泌的影响。结果,加入3-NPA培养24 h后,10、5、2.5 mmol/L组细胞中ROS含量相对于细胞对照组均显著升高(P<0.05);各组细胞上清的孕酮分泌量并无显著差异,而10、5、2.5 mmol/L组细胞中StAR、P450scc、3β-HSD mRNA的相对表达量相对于细胞对照组均极显著降低(P<0.001)。上述结果说明,3-NPA会导致鸡等级卵泡颗粒细胞的ROS生成并能显著降低StAR、P450scc、3β-HSD mRNA的相对表达量。