胃癌组织中鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ、神经纤毛蛋白2的表达变化及其意义

目的观察胃癌组织中鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)和神经纤毛蛋白2(NRP2)的表达变化,并分析COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系。方法收集手术切除的新鲜胃癌组织及其癌旁正常胃黏膜组织各60例,采用Western blotting法和免疫组化法检测胃癌组织及正常胃黏膜组织中的COUPTFⅡ、NRP2,分析COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系。结果胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为70.0%、78.3%,正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为30.0%、21.7%。胃癌组织、正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ相对表达量分别为0.84±0.22、0.68±0.34,NRP2相对表达量分别为0.86±0.17、0.58±0.22,胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2相对表达量均高于正常胃黏膜组织(P均<0.05)。胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2表达呈正相关关系(r=0.263,P<0.05)。浸润深度为T_3、T_4的胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于浸润深度T_1、T_2的胃癌组织(P均<0.05);中低分化胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于高分化胃癌组织(P均<0.05);有淋巴结转移的胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于无淋巴结转移的胃癌组织(P均<0.05)。结论 COUP-TFⅡ、NRP2在胃癌组织中高表达,并与胃癌的浸润深度、分化程度及淋巴结转移有关,二者可能协同参与了胃癌的发生和发展。

鸡卵清蛋白基因第一内含子和3′-调控区对外源基因表达的调控作用

探明鸡卵清蛋白基因(ov)第一内含子和3′-调控区对目的基因表达水平的影响,为鸡输卵管表达载体的构建提供科学依据。用牛生长激素基因(BGH)poly A序列替换鸡输卵管表达载体中ov 3′-调控区,用限制酶消化法逐步删减第一内含子序列,获得5个表达人组织激肽释放(hK1)cDNA的鸡输卵管表达载体,分别命名为pOV2K、pOV3K、pOV4K、pOV5K和pOV6K。经翅静脉给产蛋鸡注射聚乙烯亚胺包裹的相同拷贝数重组载体,通过蛋清中酶活性定量检测评价不同载体的表达水平。结果表明:受控于3.0kb ov 5′-和3′-调控区的pOV2K表达的重组酶活性明显高于用BGH poly A替换3′-调控区的pOV3K;无内含子的pOV6K表达水平显著低于含不同长度第一内含子的pOV3K、pOV4K和pOV5K,重组酶表达水平随第一内含子的缩短呈逐渐下降趋势。该试验结果表明ov第一内含子和3′-调控区对目的基因在鸡输卵管细胞中的表达具有正调节作用,应当包括在鸡输卵管表达载体中。

毛细管柱表面鸡卵清蛋白快速改性并用于等电聚焦电泳分离蛋白质

开发了一种利用鸡卵清蛋白改性毛细管柱内表面的快速方法。改性后的毛细管柱可避免蛋白质样品的吸附作用 ,在较温和的条件下 ,柱性能有很好的稳定性 。

鸡卵清蛋白基因5′端调控区的克隆及其序列分析

应用PCR技术从鸡输卵管组织基因组中扩增出了 1.0 0kb的鸡卵清蛋白基因 5′端调控区序列。序列分析表明 ,该区域含有TATA框及激素识别位点 ,具备输卵管定位表达的调控能力。为外源基因在鸡输卵管中的定位表达奠定了基础。

鸡卵清蛋白基因转录起始点的确定及表达载体的构建

采用 5′RACE方法确定鸡卵清蛋白基因转录起始点的位置 ,通过序列分析得出转录起始点为G ,从而确定出核心启动子及上游调控区的位置。应用PCR技术分别扩增两段卵清蛋白基因上游调控序列的两个片段 ,长度分别为 1 5kb和 2 9kb。经PCR测序和克隆测序后 ,针对突变的碱基进行修复 ,并将修复的两片段分别连接在带有绿色荧光蛋白报告基因pGFP N2载体上 ,为使pGFP N2载体本身的CMV启动子不影响对鸡卵清蛋白启动子的研究 ,将其切去 ,构建了P1.5koval GFP和P2 .9koval GFP两种表达载体 ,经酶切鉴定这两种表达载体构建正确。

鸡卵清提取液中大于3ku蛋白促细胞升高表达多能基因Oct-3/4和Nanog

背景:将体细胞重编程为多能干细胞在生物医学研究领域有广泛的应用价值。目的:分析鸡卵清提取液中不同分子质量的蛋白促进293T细胞升高表达多能基因Oct-3/4和Nanog的作用。方法:分离鸡卵清提取液中大于3 ku和小于3 ku的成分,用于293T细胞共培养。实验分为4组:每孔加入1×105个293T细胞,总体积500μL。对照组加入500μL培养基;另外3个孔分别加500μL鸡卵清提取液、鸡卵清大于3 ku的成分和小于3 ku的成分。采用定量PCR检测多能基因Nanog和Oct-3/4的相对表达量。结果与结论:用共培养法大于3 ku的成分有促细胞升高表达多能基因Oct-3/4和Nanog的作用,但小于3 ku的成分没有促细胞升高表达多能基因的作用。提示在鸡卵清提取液中促细胞升高表达多能基因的成分是大于3 ku的蛋白质。

鸡卵清提取液促进C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖的研究

目的研究鸡卵清提取液是否有促进间充质干细胞增殖的作用。方法分离培养C57小鼠骨髓间充质干细胞,并用细胞增殖检测试剂盒检测培养基、PBS、HBSS和鸡卵清提取液不同终浓度、不同培养时间对细胞增殖的作用。结果鸡卵清提取液在不同终浓度、培养不同时间条件下,对细胞的促增殖作用都大于培养基、PBS和HBSS。结论鸡卵清提取液能促进C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖。

鸡卵清提取液不同成分对细胞周期与细胞凋亡的影响

背景:如果一种提取液与细胞共培养后,能增加细胞周期的S期,减少细胞凋亡百分比,则证明这种提取液有促细胞增殖的作用。目的:验证鸡卵清提取液不同组分对293T细胞的增殖及细胞生长周期及细胞凋亡的影响。方法:用超滤管将鸡卵清提取液分离为大于10 ku和小于10 ku和大于3 ku和小于3 ku的成分,用于与细胞共培养,培养3 d后,检测细胞增殖,细胞周期与细胞凋亡情况。结果与结论:鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分有促细胞增殖的作用,同时有促进细胞周期S期百分比增加,细胞凋亡百分比减少的作用。结果提示鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分有促细胞增殖的作用,还有促进细胞周期S期百分比增加,细胞凋亡百分比减小的作用。

鸡卵清蛋白食物过敏大鼠中药口服治疗的实验研究

目的建立鸡卵清蛋白(OVA)食物过敏大鼠模型,利用中药复方Formula-3对食物过敏大鼠进行治疗,探讨其治疗效果及其机制。方法将24只BN大鼠按随机数字表法分为PBS对照组、OVA模型组及中药复方Formula-3治疗组,每组8只。OVA模型组与中药复方Formula-3治疗组在前6周和第7、9、11、13周分别予OVA(1mg·mL-1)灌胃致敏,每天1次;于第13周末以OVA(100mg·mL-1)进行激发,建立大鼠OVA食物过敏模型。其中中药复方Formula-3治疗组于第7周开始同时给予1mL中药复方Formula-3(150mg·mL-1)灌胃治疗,每天1次;OVA模型组则以1 mL的0.1 mmol·L-1 PBS灌胃治疗。PBS对照组致敏、激发和治疗均予以浓度为0.1mmol·L-1的PBS 1mL灌胃。激发24h后处死大鼠,测定3组大鼠血清中OVA特异性IgE水平、计算肥大细胞脱颗粒的百分比、观察肠道组织超微结构病理变化等,对治疗效果进行评价。结果OVA模型组血清中OVA特异性IgE抗体显著高于PBS对照组、脱颗粒肥大细胞数量显著多于PBS对照组(均P<0.01);中药复方Formula-3治疗组血清中OVA特异性IgE水平显著低于OVA模型组、肥大细胞脱颗粒显著少于OVA模型组(均P<0.01)。OVA模型组肠黏膜微绒毛变形,细胞内细胞器损伤,细胞间连接破坏,炎性细胞浸润增多;中药复方Formula-3治疗组微绒毛均匀整齐,细胞器基本正常,细胞间连接紧密,与OVA模型组相比病变明显轻微。结论中药复方Formula-3能有效地降低食物过敏大鼠血清中OVA特异性IgE,减少肥大细胞脱颗粒并减轻肠道的病理改变,对食物过敏有良好的治疗效果。

鸡卵清蛋白对蛋白酶抑制作用的研究

以新鲜鸡蛋清为材料,采用三氯醋酸-丙酮提取,冷丙酮沉淀,碳酸盐透析和DEAE-Cel-lulose离子交换层析分离出鸡卵清蛋白。研究了该蛋白质对蛋白酶活性的影响,结果表明鸡卵清蛋白对胰蛋白酶有强烈抑制作用并且抑制程度与温度、pH值等密切相关,能部分仰制枯草杆菌蛋白酶活性,不抑制胰凝乳蛋白酶。

鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ的功能及其在肿瘤中的作用

鸡卵清蛋白上游启动子转录因子（COUP-TF）Ⅱ是一种转录调节因子,在器官发育和血管生成的过程中起着重要的作用,近几年来发现它能调节多个信号通路来控制多种肿瘤细胞生长和血管生成及淋巴管的生成,且被证实与多种肿瘤的发生和转移有至关重要的作用^（[1]）。本文研究其在非腺癌膀胱癌中的表达,并重点对COUP-TFⅡ的表达、功能调节及其在相关肿瘤中的作用进行综述。

鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ在人胃癌组织中的表达及临床意义

目的:检测鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)在人胃癌组织中的表达,并探讨其临床意义及其影响胃癌发生、发展的可能分子机制。方法:收集66例手术切除的胃癌组织和相对应的癌旁非肿瘤组织标本,采用免疫组织化学法检测标本中COUP-TFⅡ和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白的表达,分析COUP-TFⅡ与患者临床病理特征及预后之间的关系,以及COUP-TFⅡ与其潜在靶基因MMP-2的相关性。结果:COUP-TFⅡ蛋白在胃癌和癌旁组织中的阳性表达率分别为65.2%(43/66)和19.7%(13/66),两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。COUP-TFⅡ蛋白的表达与胃癌的浸润深度、分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P<0.05),而与患者的性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)。COUP-TFⅡ蛋白阳性表达的患者术后平均生存时间比阴性表达者短,分别为(26.8±2.6)个月和(36.4±3.0)个月(χ2=4.118,P=0.042)。MMP-2蛋白在胃癌和癌旁组织中的阳性表达率分别为78.8%(52/66)和34.8%(23/66),两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。COUP-TFⅡ与MMP-2蛋白在胃癌组织中的表达呈正相关(r=0.310,P=0.011)。结论:COUP-TFⅡ蛋白与胃癌的发生、发展、侵袭、转移以及不良预后密切相关,推测可能是通过调控MMP-2的表达而发挥作用。

鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体构建及荧光定量PCR检测重组慢病毒滴度

构建鸡卵清蛋白启动子(OV 2.8kb)与含有eGFP基因的慢病毒表达载体,采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测重组慢病毒滴度。将鸡卵清蛋白启动子基因OV连接到慢病毒载体p LVshRNA-eGFP中替换质粒上CMV promoter元件,经酶切、测序鉴定获得携带OV与eGFP融合基因的重组慢病毒质粒,用QPCR检测病毒浓度滴定。结果显示,重组慢病毒质粒p LVshRNA-OV-eGFP酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的OV基因序列完全一致。在QPCR试验过程中,发现空白组和载体组的溶解曲线和扩增曲线较好,证明基因组抽提和QPCR过程无问题。最终测得病毒滴度约为1.6×10~7IU/m L。成功构建了携带OV与eGFP融合基因的慢病毒表达载体,为进一步研究卵清蛋白启动子基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体。

鸡卵清蛋白多肽的纯化及抗氧化作用的研究

采用Sephadex G-25、Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱层析法对鸡卵清蛋白多肽进行纯化。实验结果表明,鸡卵清蛋白多肽经Sephadex G-25凝胶柱层析分离出7个组分,其中组分3抗氧化活性最高,对DPPH自由基的清除率达到63.80%。组分3经Sephadex G-15凝胶柱层析,蒸馏水洗脱,得到4个组分,其中组分3-1和3-2具有较强的DPPH自由基清除能力,清除率分别为84.02%和81.17%。反相高效液相色谱图显示,组分3-1主要有一种成分。

鸡卵清蛋白基因5’ 端调控区序列表达载体的构建

本研究从鸡输卵管组织中扩增并克隆了约1400bp的鸡卵清蛋白基因5’端调控序列。经测序结果和序列分析表明其具有调控外源基因在输卵管内表达的能力,并构建了鸡卵清蛋白基因5’端调控序列调控外源基因表达载体PVAX1-OVP。

鸡卵清溶菌酶在大肠杆菌中高效表达及其活性测定

根据NCBI公布的鸡卵清溶菌酶（lysozyme，LYZ）蛋白序列按照大肠杆菌密码子喜好性化学合成鸡卵清溶菌酶基因序列。基因经酶切后与表达载体pET15b连接，获得的重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）。重组大肠杆菌经诱导表达和纯化提取后，获取大量高纯度鸡卵清溶菌酶，其纯度达90％以上。试验证明，经纯化的重组鸡卵清溶菌酶活性达到20000U／mg。本研究利用大肠杆菌表达载体成功表达了重组鸡卵清溶菌酶，并探索了简单有效的纯化和活性测定方法。为利用大肠杆菌系统规模化生产重组鸡卵清溶菌酶奠定了技术基础。

鸡卵清蛋白水解物中分离纯化出具有清除DPPH·自由基的多肽的研究

本文利用胰凝乳蛋白酶水解鸡卵清蛋白,得到鸡卵清蛋白水解物。通过包括凝胶过滤和反相高效液相法等连续柱层析法分离纯化得到一种具有较强DPPH·自由基清除能力的多肽。液质联用鉴定该物质的相对分子质量为730.4Da,结构为Cys-Pro-Asp-Gly-Asn-Ile-Leu,位于卵粘蛋白α亚单元的1742～1748,其DPPH·自由基清除率为27%(500μg/mL)。

鸡卵清提取液不同组分对293T细胞多能因子表达的影响

该研究发现,鸡卵细胞提取液有促进239T细胞多能因子表达增加的作用,将在细胞生物学有广泛的应用价值。将鸡卵清提取液分离为大于10 k Da和小于10 k Da的组分,用各提取液50%的终浓度培养293T细胞5 d,用流式细胞术检测多能因子的表达。结果表明,鸡卵清提取液及不同组分都有促进293T细胞多能因子表达增加的作用,而大于10 k Da的组分作用最明显,差别有统计学意义(P<0.01)。结果提示,鸡卵清提取液有促进239T细胞多能因子表达增加的作用,鸡卵清提取液中可能存在促进体细胞重编程作用的物质。

鸡卵清提取液中小于3kDa的成分有促细胞增殖的作用

在前期研究中发现,鸡卵清提取液有促细胞存活与增殖的作用。在该研究中,作者进一步分离鸡卵清提取液的各成分,找到促细胞增殖的主要成分。用超滤管将鸡卵清提取液分为大于3 kDa和小于3 kDa的成分,用于细胞增殖活性测定,发现鸡卵清提取液中小于3 kDa的成分有促293T细胞增殖的作用。可将鸡卵清提取液分离小于3 kDa的成分作为促293T细胞增殖的有效成分。

日本血吸虫感染对鸡卵清蛋白诱导的小鼠过敏性气道炎症的影响

目的研究日本血吸虫感染(感染后21 d)对鸡卵清蛋白(OVA)诱导的小鼠过敏性气道炎症的影响。方法20只雌性BALB/c小鼠随机分为健康对照组、感染组、OVA组、感染+OVA组,每组5只。感染组和感染+OVA组每鼠经腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴(15±2)条。感染后第21、35天,感染+OVA组和OVA组接受腹腔注射10μg OVA+2 mg铝佐剂致敏,感染后第42~46天接受1%OVA(PBS溶液)雾化激发,30 min/次,每天1次;健康对照组和感染组小鼠给予PBS雾化激发。采集感染后第35天(致敏期)、42天(致敏期)、49天(激发期)各组小鼠尾静脉血,ELISA检测血清IgE抗体和OVA特异性IgE抗体水平。感染后第49天剖杀全部小鼠,取肺和脾组织,取部分肺组织制作病理切片,苏木精伊红(HE)和过碘酸希夫氏(PAS)染色后观察肺组织血管、支气管周围炎症(炎症指数)和上皮细胞增生(增生指数)的病理学变化;另取一部分肺组织和脾组织制备单细胞悬液,流式细胞术检测CD4^+CD25^+Foxp3^+调节性T(Treg)细胞的比例。结果ELISA检测结果显示,感染后第35、42和49天,感染组小鼠血清IgE抗体的吸光度(A450值)分别为0.291±0.037、0.388±0.038和0.472±0.053,均高于健康对照组[(0.032±0.018、0.050±0.016和0.043±0.026)](P<0.01);OVA组分别为0.097±0.065、0.164±0.083和0.274±0.073,第42天和49天IgE抗体水平较健康对照组升高(P<0.01);感染+OVA组分别为0.305±0.054、0.359±0.037和0.454±0.017,均高于OVA组(P<0.01)。感染后第35、42和49天,OVA组OVA特异性IgE抗体的A450值分别为0.115±0.021、0.078±0.014和0.245±0.040,均高于健康对照组[(0.081±0.007、0.054±0.008和0.079±0.008)](P<0.01、0.05、0.05);感染+OVA组分别为0.034±0.009、0.038±0.016和0.203±0.017,均低于OVA组(P<0.01、0.01、0.05)。感染后第49天的病理学检测结果显示,健康对照组、感染组、OVA组和感染+OVA组小鼠肺组织支气管和血管周围炎细胞浸润的炎症指数分别为1.33±0.47、2.33±0.27、3.50±0.19和2.87±0.45。感染组和OVA组较健康对照组均升高(P<0.05、0.01),感染+OVA组较OVA组则降低(P<0.05)。此外,健康对照组、感染组、OVA组和感染+OVA组支气管上皮细胞的增生指数分别为0、0、2.12±0.80和1.72±0.55。OVA组高于健康对照组(P<0.05),感染+OVA组与OVA组差异无统计学意义(P>0.05)。感染后第49天流式细胞术检测结果显示,健康对照组脾和肺组织Treg细胞的比例分别为(16.24±3.06)%和(10.19±0.01)%,感染组分别为(27.23±5.62)%和(13.05±1.10)%,OVA组分别为(17.22±1.43)%和(12.34±2.25)%,感染+OVA组分别为(27.96±1.80)%和(15.04±1.41)%。感染组脾和肺组织Treg细胞的比例均高于健康对照组(P<0.05),OVA组与健康对照组的差异无统计学意义(P>0.05);感染+OVA组较OVA组脾组织Treg细胞比例升高(P<0.01),而肺组织的差异无统计学意义(P>0.05)。结论日本血吸虫感染(感染后21 d)对OVA诱导的过敏性气道炎症有明显的调节作用,可降低过敏性炎症致敏期和激发期OVA特异性IgE抗体水平,抑制OVA诱导的支气管和血管周围的炎细胞浸润,诱导脾组织Treg细胞比例的升高。