鸡卵清蛋白基因第一内含子和3′-调控区对外源基因表达的调控作用

探明鸡卵清蛋白基因(ov)第一内含子和3′-调控区对目的基因表达水平的影响,为鸡输卵管表达载体的构建提供科学依据。用牛生长激素基因(BGH)poly A序列替换鸡输卵管表达载体中ov 3′-调控区,用限制酶消化法逐步删减第一内含子序列,获得5个表达人组织激肽释放(hK1)cDNA的鸡输卵管表达载体,分别命名为pOV2K、pOV3K、pOV4K、pOV5K和pOV6K。经翅静脉给产蛋鸡注射聚乙烯亚胺包裹的相同拷贝数重组载体,通过蛋清中酶活性定量检测评价不同载体的表达水平。结果表明:受控于3.0kb ov 5′-和3′-调控区的pOV2K表达的重组酶活性明显高于用BGH poly A替换3′-调控区的pOV3K;无内含子的pOV6K表达水平显著低于含不同长度第一内含子的pOV3K、pOV4K和pOV5K,重组酶表达水平随第一内含子的缩短呈逐渐下降趋势。该试验结果表明ov第一内含子和3′-调控区对目的基因在鸡输卵管细胞中的表达具有正调节作用,应当包括在鸡输卵管表达载体中。

鸡卵清蛋白基因5′端调控区的克隆及其序列分析

应用PCR技术从鸡输卵管组织基因组中扩增出了 1.0 0kb的鸡卵清蛋白基因 5′端调控区序列。序列分析表明 ,该区域含有TATA框及激素识别位点 ,具备输卵管定位表达的调控能力。为外源基因在鸡输卵管中的定位表达奠定了基础。

鸡卵清蛋白基因5′调控序列表达载体的构建及其在鸡原代输卵管上皮细胞及鸡成纤维细胞的表达

将氯霉素乙酰转移酶 ( CAT)基因与鸡卵清蛋白基因上游调控序列融合 ,构建了 p CAT-3-OVP(鸡卵清蛋白基因 5′调控序列 )表达载体。将构建的载体与脂质体混合后制备转染液 ,转染鸡原代输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞进行瞬时表达。结果表明 ,在鸡原代输卵管上皮细胞 ,转染后 4 8h表达量最高 ,为 0 .67μg/L;而在鸡成纤维细胞 ,不论有无类固醇激素存在 ,均不表达。结果提示 ,在输卵管细胞中存在细胞特异性转录因子。

鸡卵清蛋白基因上游调控序列的克隆及序列分析

应用PCR 技术从鸡肝脏基因组中克隆了1.1 kb 的鸡卵清蛋白基因上游调控序列,并进行了序列分析。结果发现,扩增产物只有2 个碱基发生了突变,其TATA 框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异,表明已成功地克隆了鸡卵清蛋白基因上游调控序列,这为应用卵清蛋白提取生物活性物质的转基因鸡的构建研究奠定了基础。

鸡卵清蛋白基因5’ 端调控区序列表达载体的构建

本研究从鸡输卵管组织中扩增并克隆了约1400bp的鸡卵清蛋白基因5’端调控序列。经测序结果和序列分析表明其具有调控外源基因在输卵管内表达的能力,并构建了鸡卵清蛋白基因5’端调控序列调控外源基因表达载体PVAX1-OVP。

鸡卵清蛋白基因调控序列指导人促红细胞生成素转基因鸡的制备

本研究将鸡卵清蛋白 5!@端调控区调控人促红细胞生成素的pOV -hEPO特异表达载体用脂质体包埋 ,和供体细胞融合后 ,显微注射入 4 5 0枚受体胚盘 ,采用代用蛋壳法培养制备转基因鸡 ,PCR和斑点杂交检测外源基因已整合入早期鸡胚胎生殖系统 。

鸡卵清蛋白基因调控序列的克隆与载体构建

卵清蛋白(ovalbumin)基因在鸡基因组中只有一对等位基因,却能每天合成分泌多达2 g的蛋白,占据卵白蛋白质的50%以上,是外源基因载体表达调控构件的首选。该研究从输卵管特异性启动子方面着手,通过对卵清蛋白基因启动子的筛选优化,找出启动子增强因子的位置以及组织特异性区域。将卵清蛋白基因上游-922^-2 073和-2 801^-3 100区域平均分成12个长度约为150 bp的序列,分别插入到-921^+38序列的上游,成功构建12个系列表达载体,为进一步筛选短缩版优化启动子提供材料;卵清蛋白基因第一内含子区域截断成300 bp左右的迷你内含子序列,成功构建8个迷你内含子系列载体,为筛选优化的迷你内含子提供必要的材料;成功分离鸡输卵管上皮细胞并优化电转染条件,通过荧光素酶活性检测初步筛选出具有最强活性重组质粒pGL4-UP-1412和内含子重组质粒pGL4-mini-intron-3,同时推断出若干包含增强子序列区域。

鹅卵清蛋白基因5’端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鹅输卵管基因组中扩增出 1 2kb的鹅清蛋白基因 5’端调控区 ,将其亚克隆入phD18-T载体的多克隆位点 (标记为pOV) ,经酶切和测序鉴定 :扩增产物只有 3个碱基发生了突变 ,其TATA框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异 ,表明鹅清蛋白基因 5’端调控区可作为启动外源基因表达的调控序列 。

鸡卵清蛋白5′端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鸡输卵管基因组中扩增出1.1kb的鸡卵清蛋白5′调控区,将其克隆入pMD18-T载体的多克隆位点(命名为pOV),经酶切鉴定和序列测定可作为调控序列来启动外源基因的表达。为下一步构建其调控外源基因的质粒表达载体作准备。

鸡卵清蛋白基因转录起始点的确定及表达载体的构建

采用 5′RACE方法确定鸡卵清蛋白基因转录起始点的位置 ,通过序列分析得出转录起始点为G ,从而确定出核心启动子及上游调控区的位置。应用PCR技术分别扩增两段卵清蛋白基因上游调控序列的两个片段 ,长度分别为 1 5kb和 2 9kb。经PCR测序和克隆测序后 ,针对突变的碱基进行修复 ,并将修复的两片段分别连接在带有绿色荧光蛋白报告基因pGFP N2载体上 ,为使pGFP N2载体本身的CMV启动子不影响对鸡卵清蛋白启动子的研究 ,将其切去 ,构建了P1.5koval GFP和P2 .9koval GFP两种表达载体 ,经酶切鉴定这两种表达载体构建正确。

基于Cre重组酶体系的鸡卵清蛋白基因打靶载体的构建

利用胚胎干细胞基因打靶技术制备转基因鸡是研制鸡输卵管反应器的最佳技术路线。为建立基于Cre/loxp系统的鸡卵清蛋白基因(Ovalbumingene,OV)位点的双交换打靶载体系统,本研究克隆了鸡的OV基因7.8kb片段,并与克隆的内部核糖体进入位点(IRES)、人工合成的含有Cre重组酶识别位点变异体交换盒m2/loxp71EGFPloxp66,一起构建了含有Hsvtk负筛选标记的针对鸡卵清蛋白基因位点的敲入型共表达基因打靶载体pSSCm2/71EGFP66IRESOV7.8;以猪β干扰素基因(βInterferon,IFNβ)为目的基因构建了穿梭载体pMDm2/66MCSIFNMCSLoxp71,经过限制酶酶切及部分测序鉴定,所构建载体结构正确。进一步将它们共转化组成性表达Cre的细菌BM25.8。

鸭卵清蛋白5'端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鸭输卵管基因组中扩增出1.2 kb的鸭清蛋白5’端调控区,将其亚克隆入phD18-T载体的多克隆位点(命名为 pOV),经酶切和测序鉴定可作为启动外源基因表达的调控序列.为构建其启动外源基因的质粒表达载体作准备.

鸡卵清蛋白基因启动子克隆及其活性的检测

为了获得鸡输卵管特异表达的卵清蛋白基因启动子,研究在采用PCR方法从鸡心基因组DNA中扩增卵清蛋白基因启动子(5OV)的基础上,将其与p Ac GFP1-N1载体连接构建真核表达载体p Ac GFP1-5OV,并采用脂质体法将p Ac GFP1-5OV分别转染鸡输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞后,观察其在两种细胞中的表达活性。结果表明:利用克隆获得的5OV构建的真核表达载体p Ac GFP1-5OV在转染鸡输卵管上皮细胞后第24小时,在荧光倒置显微镜下可见绿色荧光,而转染鸡成纤维细胞后未观察到GFP表达。说明所克隆的5OV具有在输卵管上皮细胞特异表达的活性。

胃癌组织中鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ、神经纤毛蛋白2的表达变化及其意义

目的观察胃癌组织中鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)和神经纤毛蛋白2(NRP2)的表达变化,并分析COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系。方法收集手术切除的新鲜胃癌组织及其癌旁正常胃黏膜组织各60例,采用Western blotting法和免疫组化法检测胃癌组织及正常胃黏膜组织中的COUPTFⅡ、NRP2,分析COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系。结果胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为70.0%、78.3%,正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为30.0%、21.7%。胃癌组织、正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ相对表达量分别为0.84±0.22、0.68±0.34,NRP2相对表达量分别为0.86±0.17、0.58±0.22,胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2相对表达量均高于正常胃黏膜组织(P均<0.05)。胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2表达呈正相关关系(r=0.263,P<0.05)。浸润深度为T_3、T_4的胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于浸润深度T_1、T_2的胃癌组织(P均<0.05);中低分化胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于高分化胃癌组织(P均<0.05);有淋巴结转移的胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于无淋巴结转移的胃癌组织(P均<0.05)。结论 COUP-TFⅡ、NRP2在胃癌组织中高表达,并与胃癌的浸润深度、分化程度及淋巴结转移有关,二者可能协同参与了胃癌的发生和发展。

鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达

用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因 (ov)的 5′ 和 3′ 调控区 ,将其克隆入pGEM T载体 ,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体 ,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体 5′ 调控区的下游 ,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡 ,RT PCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达 ,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中 ,仅输卵管膨大部能检测出β 半乳糖苷酶活性 ( 1 1 6 7mU ml) ,注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用 ( 1 5 3 3mU ml) ,重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中 ( 1 7 33mU ml)。结果表明 ,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达 ,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。

Ex-FABP作为鸡腹脂性状主要候选基因的研究

细胞外脂肪酸结合蛋白(extracellular fatty acid-binding protein,Ex-FABP)基因是脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein,FABP)家族的另一成员,参与鸡的脂肪酸、肌纤维、骨骼等调控过程.利用PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)和DNA测序的方法,对不同品种的杂交鸡进行了Ex-FABP基因5'调控区部分序列的多态性分析,发现了3个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点.其中,此片段中的碱基C(-1000)的插入和碱基T→C(-1011)的突变,导致此处比野生型基因少了1个cap,多了1个Nkx-2、1个AhR/Ar和2个CF1等转录因子结合位点的产生.利用SAS软件对Ex-FABP基因5'调控区的SNPs与屠体性状的最小二乘分析,发现基因型BB(突变型)与腹脂重存在极显著相关(P<0.01).研究结果表明,细胞外脂肪酸结合蛋白(Ex-FABP)基因是影响脂肪沉积、控制腹脂性状的主要候选基因.

鸡输卵管生物反应器的研究进展

目前鸡输卵管生物反应器的研究集中在以卵清蛋白调控区来调控外源基因的表达。鸡输卵管生物反应器的研究以输卵管细胞的培养为起点 ,再研究外源基因在输卵管内定位表达的可能性 ,最后制作转外源基因能稳定遗传的转基因鸡。本文对鸡输卵管生物反应器研究作一综述 ,提出了存在的问题并作以展望。

1.1kb、2.7kb、3.0kb鸡输卵管组织特异性启动子的克隆及细胞评价

鸡卵清蛋白基因启动子是指导外源基因高效特异性表达的理想调控区,利用卵清蛋白启动子驱动外源蛋白大量表达,需要包含组织特异性相关序列。本研究以海兰白鸡的基因组为模板,采用PCR扩增了1.1 kb、2.7 kb和3.0 kb的卵清蛋白启动子区,置换pcDNA6.2-GFP中CMV启动子序列,构建了真核表达载体pOV1.1 kb-GFP、pOV2.7 kb-GFP、pOV3.0 kb-GFP;转染原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO),PCR、RT-PCR证明重组载体能够整合到细胞基因组内,并进行转录;倒置荧光显微镜下观测到绿色荧光蛋白表达;启动子表达效率由高到低依次是CMV启动子、1.1 kb、2.7 kb、3.0 kb卵清蛋白启动子。研究结果为瞬时表达模型的建立和输卵管生物反应器的研究奠定基础。

人促红细胞生成素鸡输卵管特异表达载体的构建

通过PCR技术从产蛋鸡输卵管基因组中扩增出 1 1kb的鸡卵清蛋白 5’端调控区 ,将其亚克隆入pMD18-T载体的多克隆位点 )命名为pOV) ,经酶切和测序鉴定可作为调控序列来启动外源基因的表达。然后从pOV上切下卵清蛋白 5’端调控区 ,再将其亚克隆入pBCE经SalI和HindⅢ双酶切的切口处 ,酶切鉴定为正向插入 ,成功构建了鸡卵清蛋白 5’端调控区调控人促红细胞生成素的质粒表达载体pOV -hEPO 。

碱性磷酸酯酶基因在鸡胚和人乳腺癌细胞中的表达

通过PCR方法从pSEAP2-control质粒获得人胎盘碱性磷酸酯酶(PLAP)基因,并克隆到鸡输卵管特异性表达载体(pAB-Sig-SV40)卵清蛋白基因调控区下游。pSEAP2-control和pAB-Sig-AP-SV40质粒转染鸡胚细胞和乳腺癌细胞(MCF-7),转染48h后以对硝基苯磷酸钠(pNPP)为底物检测PLAP的活性,结果pSEAP2-control在鸡胚细胞和MCF-7细胞中表达PLAP,pAB-Sig-AP-SV40在鸡胚细胞中不表达,而在MCF-7细胞中表达。说明鸡胚细胞可以表达有活性的人源糖蛋白,另外也说明在雌激素受体细胞中,鸡卵清蛋白基因启动子可启动外源基因表达。