鸡卵蛋白代替结晶酶对溶菌酶测定的试验研制

在做溶菌酶测定时需结晶酶作标准,用量少不易于操作。我们采用鸡卵蛋白代替标准结晶酶,经实验证实结果可靠,价格低,操作方便,效果满意,试验方法介绍如下。 1 试剂和材料 1.1 pH等渗磷酸盐缓冲液 1.1.1 称取磷酸二氢钾9.07g,氯化钠5.0g,溶解后加蒸馏水至1000ml。 1.1.2 称取磷酸氢二钠[Na_2HPO4·12H_2O)23.87g,氯化钠5.0g,溶解后加蒸馏水至1000ml。 1.1.3 将上两种液体以10∶3的比例混合。

鸡卵蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳

以醋酸纤维素薄膜作为支持物所做鸡蛋清的区带电泳结果表明,鸡蛋清中至少含有5种主要的蛋白质,这些蛋白质的等电点均小于pH8.6。

胃癌组织中鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ、神经纤毛蛋白2的表达变化及其意义

目的观察胃癌组织中鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)和神经纤毛蛋白2(NRP2)的表达变化,并分析COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系。方法收集手术切除的新鲜胃癌组织及其癌旁正常胃黏膜组织各60例,采用Western blotting法和免疫组化法检测胃癌组织及正常胃黏膜组织中的COUPTFⅡ、NRP2,分析COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系。结果胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为70.0%、78.3%,正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为30.0%、21.7%。胃癌组织、正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ相对表达量分别为0.84±0.22、0.68±0.34,NRP2相对表达量分别为0.86±0.17、0.58±0.22,胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2相对表达量均高于正常胃黏膜组织(P均<0.05)。胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2表达呈正相关关系(r=0.263,P<0.05)。浸润深度为T_3、T_4的胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于浸润深度T_1、T_2的胃癌组织(P均<0.05);中低分化胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于高分化胃癌组织(P均<0.05);有淋巴结转移的胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于无淋巴结转移的胃癌组织(P均<0.05)。结论 COUP-TFⅡ、NRP2在胃癌组织中高表达,并与胃癌的浸润深度、分化程度及淋巴结转移有关,二者可能协同参与了胃癌的发生和发展。

三步沉淀法纯化鸡卵类黏蛋白

鸡卵类黏蛋白(hen’s egg ovomucoid,HOVM)是鸡蛋清中最重要的过敏原蛋白,探讨三步沉淀(一步三氯乙酸沉淀以及两步硫酸铵盐析沉淀)从鸡蛋清中提取并纯化HOVM的工艺条件,并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)技术检测纯化效果。结果表明:用等体积去离子水稀释的鸡卵清液加入质量分数10%三氯乙酸去除大部分杂蛋白后,所得上清液加入硫酸铵至终饱和度50%,盐析沉淀进一步去除非HOVM的杂蛋白,上清液中最后再追加硫酸铵至终饱和度80%,离心所得沉淀再经过透析冻干即为高纯度的HOVM;HPLC(检测波长220 nm)检测所获HOVM的纯度为99.202%,此工艺条件下得到HOVM的提取率约为27.05%。

鸡卵清蛋白基因第一内含子和3′-调控区对外源基因表达的调控作用

探明鸡卵清蛋白基因(ov)第一内含子和3′-调控区对目的基因表达水平的影响,为鸡输卵管表达载体的构建提供科学依据。用牛生长激素基因(BGH)poly A序列替换鸡输卵管表达载体中ov 3′-调控区,用限制酶消化法逐步删减第一内含子序列,获得5个表达人组织激肽释放(hK1)cDNA的鸡输卵管表达载体,分别命名为pOV2K、pOV3K、pOV4K、pOV5K和pOV6K。经翅静脉给产蛋鸡注射聚乙烯亚胺包裹的相同拷贝数重组载体,通过蛋清中酶活性定量检测评价不同载体的表达水平。结果表明:受控于3.0kb ov 5′-和3′-调控区的pOV2K表达的重组酶活性明显高于用BGH poly A替换3′-调控区的pOV3K;无内含子的pOV6K表达水平显著低于含不同长度第一内含子的pOV3K、pOV4K和pOV5K,重组酶表达水平随第一内含子的缩短呈逐渐下降趋势。该试验结果表明ov第一内含子和3′-调控区对目的基因在鸡输卵管细胞中的表达具有正调节作用,应当包括在鸡输卵管表达载体中。

鸡卵类黏蛋白结构与性质研究进展

鸡卵类黏蛋白是鸡蛋中最主要也是过敏原性最强的过敏原蛋白。本文总结该蛋白的结构,包括氨基酸序列、糖基组成、二硫键位置、二级结构以及组成该蛋白的3个结构域,并描述其理化性质,最后着重分析讨论其过敏原性,特别是其分子结构中二硫键、糖基和结构域等因素与过敏原性之间的内在联系。

毛细管柱表面鸡卵清蛋白快速改性并用于等电聚焦电泳分离蛋白质

开发了一种利用鸡卵清蛋白改性毛细管柱内表面的快速方法。改性后的毛细管柱可避免蛋白质样品的吸附作用 ,在较温和的条件下 ,柱性能有很好的稳定性 。

鸡卵清蛋白基因5′端调控区的克隆及其序列分析

应用PCR技术从鸡输卵管组织基因组中扩增出了 1.0 0kb的鸡卵清蛋白基因 5′端调控区序列。序列分析表明 ,该区域含有TATA框及激素识别位点 ,具备输卵管定位表达的调控能力。为外源基因在鸡输卵管中的定位表达奠定了基础。

鸡卵清蛋白基因转录起始点的确定及表达载体的构建

采用 5′RACE方法确定鸡卵清蛋白基因转录起始点的位置 ,通过序列分析得出转录起始点为G ,从而确定出核心启动子及上游调控区的位置。应用PCR技术分别扩增两段卵清蛋白基因上游调控序列的两个片段 ,长度分别为 1 5kb和 2 9kb。经PCR测序和克隆测序后 ,针对突变的碱基进行修复 ,并将修复的两片段分别连接在带有绿色荧光蛋白报告基因pGFP N2载体上 ,为使pGFP N2载体本身的CMV启动子不影响对鸡卵清蛋白启动子的研究 ,将其切去 ,构建了P1.5koval GFP和P2 .9koval GFP两种表达载体 ,经酶切鉴定这两种表达载体构建正确。

鸡卵清白蛋白的示差扫描量热法研究

本文用示差扫描量热法 (DSC)研究了鸡卵清白蛋白的热变性 ,以及溶剂对变性的影响。给出了该蛋白质在H2 O、甲醇和乙二醇水溶液中变性的热力学参数值。实验结果表明 ,鸡卵清白蛋白热变性过程的转变温度和转变焓与样品的来源和溶剂种类有密切的关系。探讨了这些溶剂对蛋白质构象变化影响的机理。

加热对鸡卵类黏蛋白结构及其与IgG结合能力的影响

鸡卵类黏蛋白(hen's egg ovomucoid,HOVM)是存在于鸡蛋卵清中的一种致敏蛋白,而热处理是常用的一种蛋制品的加工方式。通过间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法、圆二色谱法、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)荧光探针法以及相关性分析法解释热处理对HOVM与免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)结合能力和结构的影响。结果表明:随着热处理强度(包括温度和时间)的增加,HOVM与IgG的结合能力不断下降,二级结构中的α-螺旋和β-折叠含量呈下降趋势,β-转角和无规则卷曲的含量呈上升趋势,表面疏水性指数在处理强度较低的情况下会提高,处理强度较高的情况下会下降,HOVM结合ANS后的最大荧光波长数(λmax)出现蓝移以及数值变化显示HOVM结构在热处理的作用下先变得松散,随后处理温度的攀升可能会进一步导致HOVM蛋白发生凝聚。

鸡卵清白蛋白多肽抗皮肤光老化的功能研究

本文以昆明小鼠和鸡卵清白蛋白多肽为研究对象，研究了鸡卵清白蛋白多肽对紫外线损伤的小鼠光老化皮肤的保护作用。实验动物随机分为正常对照组、模型对照组、Vc阳性对照组、卵清白蛋白多肽低剂量组、卵清白蛋白多肽高剂量组五组。除正常对照组外，运用紫外灯管模拟紫外线长期照射各组小鼠皮肤的无毛部分，建立小鼠皮肤光老化模型。同时，用5％Vc溶液、10％的鸡卵清白蛋白多肽溶液、40％的鸡卵清白蛋白多肽溶液分别外涂于Vc阳性对照组、卵清白蛋白多肽低剂量组、卵清白蛋白多肽高剂量组小鼠背部无毛皮肤，正常对照组和模型对照组涂抹蒸馏水。60天后，观察各组小鼠皮肤的表观特征并测定相关生化指标。结果显示，与模型对照组相比，鸡卵清白蛋白多肽高、低剂量组小鼠皮肤光滑，褶皱较浅，富有弹性，红斑极少，接近正常对照组小鼠皮肤；皮肤重量均显著降低（p〈0．01，p〈0．01），羟脯氨酸（HPY）含量均显著降低（p〈0．01，p〈0．05），丙二醛（MDA）含量存在显著差异（p〈0．05，p〈0．05），超氧化物歧化酶（SOD）活力显著增强（p〈0．05，p〈0．05）。说明鸡卵清白蛋白多肽对小鼠光老化皮肤有明显的保护作用。

鸡卵清白蛋白溶液最佳离心分离条件的研究

本文研究了采用离心分离法去除鸡卵清白蛋白(以下简称卵清蛋白)溶液中可见杂质的方法,确定了离心分离的最佳离心速度、离心时间和离心温度。结果表明:离心速度10000r/min、离心时间30min、离心温度4℃可达到最佳的分离效果。本研究具有一定的实用性,可为卵清蛋白溶液作为超滤膜截留性能测试的使用液提供技术保障。

鸡卵清蛋白食物过敏大鼠中药口服治疗的实验研究

目的建立鸡卵清蛋白(OVA)食物过敏大鼠模型,利用中药复方Formula-3对食物过敏大鼠进行治疗,探讨其治疗效果及其机制。方法将24只BN大鼠按随机数字表法分为PBS对照组、OVA模型组及中药复方Formula-3治疗组,每组8只。OVA模型组与中药复方Formula-3治疗组在前6周和第7、9、11、13周分别予OVA(1mg·mL-1)灌胃致敏,每天1次;于第13周末以OVA(100mg·mL-1)进行激发,建立大鼠OVA食物过敏模型。其中中药复方Formula-3治疗组于第7周开始同时给予1mL中药复方Formula-3(150mg·mL-1)灌胃治疗,每天1次;OVA模型组则以1 mL的0.1 mmol·L-1 PBS灌胃治疗。PBS对照组致敏、激发和治疗均予以浓度为0.1mmol·L-1的PBS 1mL灌胃。激发24h后处死大鼠,测定3组大鼠血清中OVA特异性IgE水平、计算肥大细胞脱颗粒的百分比、观察肠道组织超微结构病理变化等,对治疗效果进行评价。结果OVA模型组血清中OVA特异性IgE抗体显著高于PBS对照组、脱颗粒肥大细胞数量显著多于PBS对照组(均P<0.01);中药复方Formula-3治疗组血清中OVA特异性IgE水平显著低于OVA模型组、肥大细胞脱颗粒显著少于OVA模型组(均P<0.01)。OVA模型组肠黏膜微绒毛变形,细胞内细胞器损伤,细胞间连接破坏,炎性细胞浸润增多;中药复方Formula-3治疗组微绒毛均匀整齐,细胞器基本正常,细胞间连接紧密,与OVA模型组相比病变明显轻微。结论中药复方Formula-3能有效地降低食物过敏大鼠血清中OVA特异性IgE,减少肥大细胞脱颗粒并减轻肠道的病理改变,对食物过敏有良好的治疗效果。

鸡卵转铁蛋白结构与功能的关系

鸡卵转铁蛋白是鸡蛋卵清中的一种单亚基糖蛋白,可结合并转运Fe3+离子。目前研究发现该蛋白及其水解产物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤以及免疫调节等性能,本文着力分析讨论这些生物学功能与其分子组成或空间结构的内在关系。

鸡卵清蛋白对蛋白酶抑制作用的研究

以新鲜鸡蛋清为材料,采用三氯醋酸-丙酮提取,冷丙酮沉淀,碳酸盐透析和DEAE-Cel-lulose离子交换层析分离出鸡卵清蛋白。研究了该蛋白质对蛋白酶活性的影响,结果表明鸡卵清蛋白对胰蛋白酶有强烈抑制作用并且抑制程度与温度、pH值等密切相关,能部分仰制枯草杆菌蛋白酶活性,不抑制胰凝乳蛋白酶。

鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ的功能及其在肿瘤中的作用

鸡卵清蛋白上游启动子转录因子（COUP-TF）Ⅱ是一种转录调节因子,在器官发育和血管生成的过程中起着重要的作用,近几年来发现它能调节多个信号通路来控制多种肿瘤细胞生长和血管生成及淋巴管的生成,且被证实与多种肿瘤的发生和转移有至关重要的作用^（[1]）。本文研究其在非腺癌膀胱癌中的表达,并重点对COUP-TFⅡ的表达、功能调节及其在相关肿瘤中的作用进行综述。

鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ在人胃癌组织中的表达及临床意义

目的:检测鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)在人胃癌组织中的表达,并探讨其临床意义及其影响胃癌发生、发展的可能分子机制。方法:收集66例手术切除的胃癌组织和相对应的癌旁非肿瘤组织标本,采用免疫组织化学法检测标本中COUP-TFⅡ和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白的表达,分析COUP-TFⅡ与患者临床病理特征及预后之间的关系,以及COUP-TFⅡ与其潜在靶基因MMP-2的相关性。结果:COUP-TFⅡ蛋白在胃癌和癌旁组织中的阳性表达率分别为65.2%(43/66)和19.7%(13/66),两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。COUP-TFⅡ蛋白的表达与胃癌的浸润深度、分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P<0.05),而与患者的性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)。COUP-TFⅡ蛋白阳性表达的患者术后平均生存时间比阴性表达者短,分别为(26.8±2.6)个月和(36.4±3.0)个月(χ2=4.118,P=0.042)。MMP-2蛋白在胃癌和癌旁组织中的阳性表达率分别为78.8%(52/66)和34.8%(23/66),两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。COUP-TFⅡ与MMP-2蛋白在胃癌组织中的表达呈正相关(r=0.310,P=0.011)。结论:COUP-TFⅡ蛋白与胃癌的发生、发展、侵袭、转移以及不良预后密切相关,推测可能是通过调控MMP-2的表达而发挥作用。

鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体构建及荧光定量PCR检测重组慢病毒滴度

构建鸡卵清蛋白启动子(OV 2.8kb)与含有eGFP基因的慢病毒表达载体,采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测重组慢病毒滴度。将鸡卵清蛋白启动子基因OV连接到慢病毒载体p LVshRNA-eGFP中替换质粒上CMV promoter元件,经酶切、测序鉴定获得携带OV与eGFP融合基因的重组慢病毒质粒,用QPCR检测病毒浓度滴定。结果显示,重组慢病毒质粒p LVshRNA-OV-eGFP酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的OV基因序列完全一致。在QPCR试验过程中,发现空白组和载体组的溶解曲线和扩增曲线较好,证明基因组抽提和QPCR过程无问题。最终测得病毒滴度约为1.6×10~7IU/m L。成功构建了携带OV与eGFP融合基因的慢病毒表达载体,为进一步研究卵清蛋白启动子基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体。