IHH 过表达对鸡原代软骨细胞增殖和分化的影响

为探究印度刺猬因子(IHH)基因对鸡原代软骨细胞增殖和分化的调控作用,本研究根据IHH基因序列信息,构建真核过表达载体(OV-IHH);采用双酶切和测序进行鉴定,并将其转染鸡原代软骨细胞;采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,对软骨细胞进行成骨诱导分化至21 d,采用ALP试剂盒检测细胞ALP活性。结果表明,IHH真核过表达载体构建成功,与对照组和空载体组(OV-NC)相比,过表达组IHH基因的mRNA表达显著增加(P<0.01),过表达效率扩大2700倍左右。过表达IHH促进细胞周期从G1期到S期的转换,从而促进增殖,抑制细胞凋亡,且ALP活性升高,促进细胞分化。综上,IHH基因显著影响鸡软骨细胞的生长发育,研究结果为进一步解析IHH基因调控鸡匍匐性状的作用机制提供理论依据。

鸡胚原代软骨细胞的分离培养及表型鉴定

选取不同日龄的SPF鸡胚进行骨架染色,确定软骨最佳取材日龄为15日龄,分离关节软骨,采用胰蛋白酶和Ⅳ型胶原酶两步消化法获取软骨细胞。CCK-8法检测细胞增殖率,阿利新蓝染色及实时荧光定量PCR技术检测软骨细胞标志性基因表达来鉴定分离培养的软骨细胞。结果显示,分离培养的软骨细胞3~5 d时增殖较快,阿利新蓝染色阳性,能够表达sox9、colⅡ、acan、vegfA和mmp13等不同分化阶段标志性基因,且随着体外培养时间的增加,晚期表达基因vegfA和mmp13 mRNA表达上调。结果表明,分离培养的鸡胚软骨细胞具有软骨细胞表型,可作为家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病研究模型。本试验旨在建立鸡胚原代软骨细胞的体外培养体系,以期为家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病研究提供理论依据。