培养副鸡嗜血杆菌用干粉培养基的优化研究

优化副鸡嗜血杆菌干粉培养基配方。通过单因素平行对比配方中碳源、血清、辅酶等营养物质,确定各个因素对副鸡嗜血杆菌生长的影响。研究筛选出了适宜副鸡嗜血杆菌生长的干粉培养基配方:鸡肉蛋白胨、酪胨、多价胨、酵母粉、葡萄糖等,再添加7.5%鸡血清和10 mg/L辅酶Ⅰ,于37℃、5%CO_(2)恒温培养箱中160 r/min振荡培养14~16 h。优化后的配方更适于培养副鸡嗜血杆菌,为副鸡嗜血杆菌疫苗大规模生产提供了参考依据。

B型副鸡嗜血杆菌的分离鉴定

从辽宁某公司鸡场疑似鸡传染性鼻炎的病鸡眶下窦分离到一株副鸡嗜血杆菌 ,用Page程序和Kume程序对其进行血清型鉴定 ,确认为B型副鸡嗜血杆菌 ,这是首次在我国分离到B型副鸡嗜血杆菌。

副鸡嗜血杆菌的分离鉴定及我国鸡传染性鼻炎的流行状况分析

从不同地区免疫失败鸡场的鸡传染性鼻炎疑似鸡体内共分离到19株细菌,经回归试验、PCR等方法鉴定为副鸡嗜血杆菌。又将分离株用血清平板凝集试验、血凝抑制试验和型特异性单抗进行了血清型的鉴定,结果表明分离菌有15株为A型,4株为B型,说明我国鸡传染性鼻炎的流行已经出现了新的特点,在疾病预防和控制中应加以注意。另外大多数鸡场的免疫失败是由于免疫效果不良所致,但也有相当一部分鸡场的免疫失败是由于B血清型的出现引起的。

副鸡嗜血杆菌的分离鉴定

副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum,HPG)是鸡传染性鼻炎的病原菌。近年来,北京、陕西、四川等地证明了该病的发生。为了了解该病在山东省的流行状况,从山东德州地区5个鸡场的20只疑似鸡传染性鼻炎鸡体内共分离到6株细菌,经细菌分离培养、生化试验、鸡胚接种试验和16s rDNA基因序列分析等方法鉴定为副鸡嗜血杆菌。并经玻片凝集试验、Dot-ELISA、血凝试验分型研究,证实6株分离菌株均为副猪嗜血杆菌A型。从而为以后鸡传染性鼻炎的免疫治疗提供理论依据。

Dot-ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清型特异性抗原的研究

本研究在副鸡嗜血杆菌型特异性单克隆抗体的基础上建立了检测该菌 Ａ、 Ｃ 型特异性抗原的 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 方法，结果表明本方法在检测副鸡嗜血杆菌型特异性抗原时未呈现与其它 ８ 种常见病原体的交叉反应，新鲜肉汤的最低检出量为 Ａ 型 １３×１０６ Ｃ Ｆ Ｕ／ｍ ｌ和 Ｃ 型 ８×１０６ Ｃ Ｆ Ｕ／ｍ ｌ，抗原的最低检出量均为 ２５μｇ／ｍ ｌ，对 ２０ 份抗原、肉汤和卵黄样品的检测结果与其已知结果相符。这就证明本方法具有较好的敏感性和特异性，是一种能直接检测分离株血清型的良好方法。

副鸡嗜血杆菌的分离鉴定及16SrRNA序列分析

从云南省和四川省规模化养鸡场鸡传染性鼻炎疑似病例鸡鼻窦分离到2株革兰氏阴性小杆菌,并对其进行生化鉴定、PCR鉴定和16SrRNA序列比对鉴定。16SrRNA分析表明两分离株与GenBank中的其他副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum,HPg）参考株核苷酸同源性为94.2%~99.2%。两分离菌株鉴定为副鸡嗜血杆菌,分别命名为YNAN20120110和SCPZH20120120株。16SrRNA遗传进化关系表明：分离株与NAD非依赖型副鸡嗜血杆菌血清A型代表株GU951543（HP105strain）的16SrRNA序列位于一个分支上,遗传进化关系最近,它们之间的核苷酸同源性为99.2%;与副鸡嗜血杆菌血清A型参考株AY498867（0083株）核苷酸同源性为96.9%。致病性实验表明分离菌株对成年产蛋鸡有强致病性。抗生素药物敏感试验表明：分离菌株对头孢吡肟、头孢噻吩、氯霉素、卡那霉素和氧氟沙星高敏,对四环素中敏,对磺胺甲唑耐药。

单抗阻断ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清型特异性抗体的研究

本研究在副鸡嗜血杆菌Ａ、Ｃ型特异性单克隆抗体的基础上成功地建立了能区分Ａ、Ｃ血清型抗体的阻断ＥＬＩＳＡ诊断方法，并应用此法对９种常见病原体阳性血清及多份免疫鸡、人工感染鸡、临床可疑病鸡血清和阴性血清进行了检测，结果证明，本方法具有较好的特异性和敏感性，而且操作简便、快速，是一种适用于鸡传染性鼻炎的诊断、流行病学调查、检疫和监测的良好方法。

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及其产物的生物学活性鉴定

根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列,设计合成了1对特异性引物,以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板,利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因(1 035 bp),将其克隆到pET-32a(+)载体上,构建了原核表达载体pET-HA,表达并纯化了重组蛋白,通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示,表达并纯化的HpgHA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合,并且可以凝集鸡红细胞。表明,成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体,并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg-HA融合蛋白。

二株副鸡嗜血杆菌分离株的生物学特性鉴定

本试验对从广西分离的 4株疑似副鸡嗜血杆菌 (H .pg) (GX_95 ,GX_97,GX_98_1,GX_98_2 )进行生物学特性研究。根据生物学特性 ,GX_97和GX_98_1被定为H .pg,GX_95和GX_98_2的生化反应特性有明显差异 ,用标准H .pg血清未能定型。交叉血凝抑制 (HI)试验显示 ,各菌株之间的交叉HI效价达 16 0 ,但各菌株与其本身的抗血清HI效价达 12 80 ,显示出很强的菌株特异性。抗菌素敏感试验也显示GX_97。

B型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及生物活性鉴定

血凝素是副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum,Hpg)的主要抗原成分之一,鸡只对Hpg的免疫力与血凝素抗体滴度成正相关。根据GenBank上已发表的B型Hpg Dalian株的血凝素基因序列(AY622378),设计合成了1对特异扩增Hpg血凝素基因的引物。以大连分离株Hpg中提取的细菌DNA为模板,利用PCR扩增出了1 038 bp的血凝素基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建了pET-HA原核表达质粒并在BL21大肠杆菌中过量表达。血凝试验显示纯化的重组蛋白具有血凝活性;Western试验证明该重组蛋白可以被B型Hpg特异性鸡血清所识别。本研究在国内首次对Hpg的血凝素基因进行克隆表达,并分析了重组蛋白的血凝活性。

副鸡嗜血杆菌16 S rDNA PCR检测方法的建立

根据副鸡嗜血杆菌的16 S rDNA基因序列设计一对特异性引物XZIC1和XZIC2,对6株副鸡嗜血杆菌进行PCR扩增。结果显示,该对引物对6株副鸡嗜血杆菌均扩增出与预期大小相一致的282bp片段,而对鸡毒支原体、禽巴氏杆菌、鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌、禽流感病毒(H9)、鸡喉气管炎病毒及葡萄球菌等9种病原体的扩增结果均为阴性。该PCR敏感性结果表明,本方法可以检测到10pg的副鸡嗜血杆菌DNA模板。采用引物XZIC1和XZIC2,对分别用副鸡嗜血杆菌ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269株感染SPF鸡的临床病料DNA进行PCR扩增,均可扩增出单一的282bp的片段。

Dot_ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清抗体的研究

本研究建立了检测副鸡嗜血杆菌特异性抗体的Dot_ELISA方法,结果证明,本方法不与8 种常见病原体产生交叉反应,对人工感染和临床病鸡的检出率为80% ,抗原预点膜在4℃可保存5 周以上,采用抗原预点膜进行检测可使整个过程在90分钟内完成,因此本方法是一种具有较高敏感性和特异性。

禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立鉴别禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)和大肠杆菌(Escherichia coli)的多重PCR检测方法,参照GenBank中登录的3种细菌基因组序列,合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立快速检测3种细菌的多重PCR方法。特异性试验结果表明,可分别扩增出3种细菌对应的目的片段,对Ⅰ群禽腺病毒4型(FAV-4)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验结果表明,最低检测量分别为24.3pg/μL禽多杀性巴氏杆菌、21.4pg/μL副鸡嗜血杆菌和28.6pg/μL鸡大肠杆菌的基因组DNA;应用该方法对83份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单重PCR检测一致,说明所建立的方法可用于临床上3种细菌的鉴别诊断。

混合感染中鸡毒支原体和副鸡嗜血杆菌的分离鉴定

从冀南地区某养鸡场患呼吸道疾病的病鸡群采集 5份样品 (气管和眶下窦分泌物 )中 ,同时分离到鸡毒支原体和副鸡嗜血杆菌两种病原体。通过病原的分离培养、细菌L型检验、生化试验、血清学试验等鉴定 ,证明分离的鸡毒支原体与国际标准株S6的血清型一致 ,副鸡嗜血杆菌的血清型为A型。动物试验表明 ,分离的鸡毒支原体和副鸡嗜血杆菌均具有明显的致病性 。

副鸡嗜血杆菌分离株致病性和生长特性试验

为研究副鸡嗜血杆菌河北省分离株W菌株致病性及生长特性,以不同剂量对80日龄公鸡进行致病性试验。对W菌株16 h培养物进行100倍稀释,采用微量点板计数法在不同培养时间进行细菌计数以绘制生长曲线。结果表明,试验鸡接菌量在1.11×104cfu/只时发病率可以达到100%,由生长曲线计算W菌株的世代时间为25.33 min。W菌株可能成为研制优良鸡传染性鼻炎疫苗的候选菌株。

藏鸡副鸡嗜血杆菌的分离及16S rDNA序列分析

四川省某藏鸡场藏鸡发生以鼻腔与窦发炎、颜面肿胀、流鼻涕和打喷嚏为主要特征的疾病,通过对送检病鸡病原的分离纯化、生化鉴定、16 S rDNA基因的克隆和序列分析诊断为副鸡嗜血杆菌感染,将该株副鸡嗜血杆菌的16 S rDNA序列与GenBank中15株巴氏杆菌科菌株进行同源性分析发现,与6株副鸡嗜血杆菌同源性较高,为94.2%～97.2%,与其它菌株16 S rDNA基因的同源性较低。另外,药敏试验表明,本菌株对菌必治、阿莫西林、庆大霉素、头孢氨噻肟和阿奇霉素等药物敏感。

副鸡嗜血杆菌PCR试验及应用

在Ｈｐｇ核酸探针试验基础上设计ＰＣＲ引物和ＰＣＲ试验方法。检测４１株Ｈｐｇ和２６株非Ｈｐｇ证明ＰＣＲ试验特异性好，敏感性比Ｈｐｇ核酸探针高１０００～１０，０００倍。用ＰＣＲ检验直接临床棉拭子样品，与Ｈｐｇ细菌分离结果完全一致。ＰＣＲ试验简便敏感快速，有可能作为一种新方法用于临床Ｈｐｇ诊断。

副鸡嗜血杆菌贵州株的分离鉴定

为查明贵州省某规模化养鸡场患病鸡的病原,从患病鸡内脏及眶下窦处采集病料,分离到1株细菌,对其进行革兰染色镜检、生化试验及16SrRNA序列比对。序列比对表明,该分离株16SrRNA与GenBank中各亚型副鸡嗜血杆菌株16SrRNA的核苷酸同源性在93.6%～99.4%之间,证实其为副鸡嗜血杆菌,将其命名为HPG-GZ-2017。遗传进化树分析表明,HPG-GZ-2017与C型标准菌株CAPM 5111(GenBank:M75056)处于同一小分支,亲缘关系较近,核苷酸同源性也较高。动物感染试验表明其致病性较低。药敏试验表明,HPG-GZ-2017对头孢克洛高敏,对红霉素中敏,对四环素、环丙沙星、卡那霉素、青霉素、诺氟沙星、头孢拉定低敏,对复方新诺明、链霉素耐药。研究结果可为副鸡嗜血杆菌病的防治提供依据。