鸡新城疫融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

根据NDVNL株的F基因序列，自行设计带有XbaⅠ和XhoⅠ酶切位点的一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增含NDVF基因的PFL质粒,扩增结果与设计相符，大小为630bp。该片段覆盖F基因的2/3的抗原决定簇。对该片段两端酶切后，克隆到融合表达载体pThioHisB中，并转化到大肠杆菌Top10内，利用AMP抗性筛选阳性重组子，并用PCR及双酶切鉴定克隆成功，用IPTG化学诱导表达了F基因。经SDS－PAGE电泳分析，结果在分子量约为35KD处可见到表达的蛋白条带。这与根据核苷酸大小计算的蛋白及融合蛋白之和的大小相符。说明外源片段插入正确表达成功。用HRP标记的兔抗鸡抗体与该条带进行Western－Blot检测，该条带呈阳性反应。进一步证实表达正确。通过蛋白灰度扫描显示表达的融合蛋白占菌体总蛋白的20％。

鸡新城疫病毒融合蛋白基因的克隆及进化分析

根据GeneBank中报道的NDV融合蛋白基因（F）序列，设计了一对特异性引物，用该引物对NDVLN—SN株进行了RT—PCR扩增；将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pGEM—F，用于核苷酸序列测定。结果该基因ORF长1662bp，编码553个氨基酸；将LN—SN毒株与GeneBank中已报道的NDV毒株进行比较，F基因核苷酸序列的同源性在83．4％～99．9％之间，推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88．4％-99．8％之间。

鸡新城疫病毒B_(95)株融合蛋白基因的克隆与序列分析

以鸡新城疫病毒(NDV)澳大利亚布里斯班分离株R_(95)的基因组RNA为模板,运用RT—PCR技术扩增其融合蛋白(F_0)基因的cDNA。将扩增的F基因克隆到质粒PUC_(19)中,转化入大肠杆菌JM109中,经AIX平板筛选,PCR等方法鉴定出F基因的阳性重组质粒,同时测定了F基因5’端709个核苷酸及3’端768个核苷酸的序列。对相应的氨基酸序列的研究表明,B_(95)株属弱毒株,含有F_0中保守的疏水功能区和可糖基化位点,B_(95)与强毒株F_(48)E_8株、Miyadera株和中等毒力的Beaudette C株的氨基本酸序列抽源性在90%左右。

4株鹅源新城疫病毒融合蛋白基因的克隆及序列分析

测定了 4株鹅源新城疫病毒 (NDV)融合蛋白 (F)基因 5’端 1 70 0核苷酸片段的序列 ,并由此推导了F蛋白氨基酸序列 ,并对鹅源NDV的基因型分类地位进行探讨。结果表明 ,4株病毒F基因的同源性大于 97% ,与DNV标准强毒株F48E8F基因的同源性为 86 0 %～86 8% ,F基因转录起始序列及起始密码子位置与已知NDV完全相同 ;F蛋白具有和已知NDV相似的各种功能区 ,F蛋白前体F0裂解位点附近的氨基酸序列为112 RRQKRF117,符合NDV强毒株的特征。对F基因第 3 3 4～ 1 6 82位核苷酸之间 3种限制性内切酶HinfⅠ、BstoⅠ、RsaⅠ酶切图谱的分析表明 。

新城疫病毒F_(48)E_8株融合蛋白基因序列分析

本研究报道了新城疫病毒（ＮＤＶ）中国标准强毒株Ｆ４８Ｅ８融合蛋白（Ｆ）基因的序列。该基因核苷酸序列长度为１７００ｂｐ，编码由５５３个氨基酸组成的Ｆ０多肽。Ｆ０酶切激活部位序列为ＲＲＱＲＲ↓Ｆ，具有ＮＤＶ强毒的特征。Ｆ０中有３个主要由疏水性氨基酸组成的区域和６个可糖基化位点。经比较，ＮＤＶＦ４８Ｅ８株和Ｍｉｙａｄｅｒａ株、ＴｅｘａｓＧＢ株的氨基酸同源性分别为９３６４％和９２４１％。

新城疫病毒F蛋白细胞融合活性位点中保守氨基酸基因突变分析

为了确定新城疫病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中保守氨基酸在F蛋白的细胞融合作用,弄清F细胞融合的分子机理,采用基因定点突变法,创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并于真核细胞内进行表达,Giemsa染色定性和指示基因法定量检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况。结果表明,NDV F第117位苯丙氨酸(F)突变成亮氨酸(L)时对细胞融合作用没有显著影响。R112和K115同为保守序列,分别突变为G时,细胞融合活性只有原来的44%,下降了56%。细胞表面表达效率没有明显的改变。N147突变为K时,细胞融合活性明显下降,只有原来的15%,而细胞表面表达效率没有明显的改变。L154为保守序列,突变为K时,细胞融合活性消失,说明L154是一个非常关键的氨基酸,对维持F蛋白的细胞融合活性非常重要。细胞表面表达效率也有所下降(为原来的94%)。D462属于高度保守氨基酸,当突变为N时,细胞融合活性消失,但经细胞表面表达效率分析证明,此突变蛋白未表达于细胞表面,证明在细胞浆转运至细胞表面的过程中发生了问题。当突变为R和E时,细胞融合活性未发生改变,但细胞表面表达效率有所下降,分别为野毒株的63%和44%。说明NDV F分子上与HN相互作用的特异性区域中的某些保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用,对F蛋白的折叠、加工、转运等,发挥着不同作用,从而影响F蛋白的细胞融合作用和/或在细胞表面的表达量。

新城疫病毒F_(48)E_(8)株融合蛋白基因的克隆

以提纯的我国标准ＮＤＶＦ４８Ｅ８强毒株基因组ＲＮＡ为模板、化学合成的融合蛋白（Ｆ）基因特异寡核苷酸为引物，反转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ，并采用同聚物加尾的方法克隆到细菌质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（－）。经ＡＩＸ平板筛选和酶切分析，并用Ｆ基因片段核酸探针作ｄｏｔ－ｂｌｏｔ检测，共获得插入片段长度在０．６～２．８ｋｂ之间的阳性克隆３４个，其中插入片段大于１．５ｋｂ的阳性克隆８个。用多种限制性内切酶对阳性克隆ｐＦ７（１．８ｋｂ）作酶切分析，其结果与国外报道的几株Ｆ基因相符。

新城疫病毒鹌鹑分离株融合蛋白基因的克隆与序列分析

本研究以一株从自然发生新城疫病死的鹌鹑中所分离到的新城疫病毒（QNDV／89）为研究对象，用反转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）对QNDV／89株的F全基因进行分段扩增、定向克隆到pUC119载体后，采用Sanger’s双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列，并推导出相应氨基酸序列。QNDV／89株F基因全长1662bp，单一的开放阅读框编码553个氨基酸的多肽，其裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-R-R-F117，是NDV强毒株所特有的序列结构，这与其生物学特性及致病性实验结果是相一致的。序列分析结果表明，QNDV／89株与F48E9株的核苷酸同源率高达99.22％，氨基酸的同源率为98.37％;而与弱毒株LaSota的核苷酸同源率为88.93％，氨基酸的同源率为90.42％。本研究首次报道了流行于我国鹌鹑中的新城疫强毒融合蛋白基因序列，并与其它新城疫病毒进行了同源性比较，证明QNDV／89株核苷酸的变异引起了其蛋白质二级结构的部分改变。

新城疫病毒F48E9株融合蛋白基因核苷酸序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出新城疫病毒国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的融合蛋白基因的ｃＤ－ＮＡ。经双粘端定向克隆到ｐＵＣ１９的多克隆位点中，采用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧末端终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。Ｆ基因全长为１６６２个ｂｐ，单一的开放阅读框编码５５３个氨基酸的多肽。Ｆ蛋白的疏水构型有三个强疏水区；其裂解位点的氨基酸序列为１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｒ－１１６Ｒ－１１７Ｆ；Ｆ蛋白上共有１２个Ｃｙｓ残基位点和五个潜在糖基化位点。

转新城疫病毒融合蛋白基因水稻植株的获得

以编码新城疫病毒融合蛋白 (NDV -F)基因为外源基因 ,与玉米泛素蛋白 (Ubi)启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因(NOS)终止子构建成嵌合基因 ,构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的表达质粒pUNDV ;并以潮霉素磷酸转移酶 (HPT)基因作选择标记基因、β -半乳糖苷酸酶 (GUS)基因作报告基因 ,借助于农杆菌介导转化水稻 ,获得了多株转基因植株。PCR分析和GUS活性检测结果证实含有NDV -F基因的T -DNA已整合到水稻基因组中。为研制廉价的转基因水稻新城疫基因工程疫苗奠定了基础。

新城疫病毒中国株F_(48)E_9融合蛋白基因序列分析

该研究经全自动序列测定 ,获得了新城疫病毒中国株F4 8E9融合蛋白 (F)基因 1 838bp的cDNA核苷酸序列 ,并推导出编码 5 49个残基的氨基酸序列 序列分析表明 ,该序列中有 6个潜在的糖基化位点 ,1 3个半胱氨酸残基 ,裂解位点区氨基酸序列为Arg Arg Gln Arg Arg Phe 同源性分析表明 ,新城疫病毒中国株F4 8E9融合蛋白 (F)氨基酸序列与国外发表的其他新城疫病毒株F蛋白相比 ,同源性在 96 .1 7%～ 92 .1 6

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

重组和构建了新城疫病毒（ＮＤＶ）融合蛋白基因，并对该基因进行了鉴定。结果显示，将ＮＤＶＦｘ基因片段经ＲＴＰＣＲ扩增，插入经ＥｃｏＲⅠ和（或）ＳａｌⅠ酶切克隆载体ｐＵＣ１８及表达载体转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９株。用氨苄青霉素平板法初步筛选克隆，双酶切法、核酸探针、ＰＣＲ及核苷酸序列分析法鉴定后，表明插入成功且阅读框架正确。

根癌农杆菌介导的转新城疫病毒融合蛋白基因水稻植株的获得

利用转基因植物作为生物反应器可以表达重组蛋白、生产外源蛋白质,也可以成为动物疫苗的廉价生产系统.以编码新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)的基因为外源基因,以玉米泛素蛋白(Ubi)启动子为启动子,以潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因作为选择标记基因,β-半乳糖苷酸酶(GUS)基因作为报告基因构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的表达质粒pUNDV,并通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株.通过PCR分析和GUS活性检测,证实含有NDV-F基因的T-DNA已整合到水稻核基因组中,为研制廉价安全的转基因水稻新城疫基因工程疫苗奠定了基础.

新城疫病毒分离株融合蛋白基因的遗传变异分析

根据GenBank中报道的NDV融合蛋白基因(F)序列,设计了一对特异性引物,用该引物对所分离的LN-SN株进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-F,用于核苷酸序列测定。结果该基因ORF长1662bp,编码553个氨基酸;将LN-SN毒株与GenBank中已报道的NDV毒株进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在83.1%～98.9%之间,推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88.1%～99.5%之间。

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致。

新城疫病毒融合蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

用新城疫病毒(NDV)F48E8株作为包被抗原,建立了检测由鸡痘病毒载体介导表达的NDV融合蛋白(F)抗体的间接ELISA方法。通过对20份阳性血清的P/N值与ELISA抗体效价(ET)的自然对数值(lnET)的线性回归分析,获得了回归方程lnET=0.201×P/N+4.632。应用该ELISA方法对表达NDVF基因的重组鸡痘病毒免疫鸡群进行了血清抗体检测,结果表明,血清的ELISA抗体效价与相应血清中和试验的抗体效价高度相关。攻毒保护试验的结果显示,ELISA抗体效价与机体的保护力表现一定程度的相关性。

重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析

目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。

TMPRSS2-ERG融合基因在前列腺癌中的研究进展

在前列腺癌中,跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane serine protease 2,TMPRSS2)-E26转化特异性相关基因[E26 transformation-specific(ETS)-related gene,ERG]融合基因由雄激素调控基因TMPRSS2(染色体21q22.2)与ERG(染色体21q22.3)融合形成。TMPRSS2-ERG可导致ERG过表达,过表达的ERG在多种因素协同作用下可引起相关靶基因表达并激活下游信号通路,从而参与前列腺癌的发生、发展过程。TMPRSS2-ERG有望成为前列腺癌的有效治疗靶点。本文对TMPRSS2-ERG在前列腺癌中的作用机制及其在前列腺癌诊疗中的研究进展进行综述。

融合基因BCR-ABL(P190、P210、P230)对ALL和CML的鉴别诊断价值

目的:研究融合基因BCR-ABL(P190、P210、P230)对急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性粒细胞白血病(CML)的鉴别诊断作用。方法:选取高邮市人民医院2020年1月~2023年1月收治的80例白血病患者作为研究对象。将其按照疾病类型分为ALL组(n=45)与CML组(n=35)。选用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测融合基因BCR-ABL(P190、P210、P230)表达情况。对比两组融合基因BCR-ABL(P190、P210、P230)阳性率及血清白细胞介素(IL)-6、IL-22、巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平。以Spearman相关性分析明确融合基因BCR-ABL(P190、P210、P230)阳性率与血清IL-6、IL-22、MCP-1水平的关系。此外,分析不同病程CML患者融合基因BCR-ABL(P190、P210、P230)阳性率的差异。结果:ALL组融合基因BCR-ABL P190、P210、P230阳性率均低于CML组(均P<0.05)。ALL组血清IL-6、IL-22及MCP-1水平均高于CML组(均P<0.05)。经Spearman相关性分析证实,白血病患者融合基因BCR-ABL P190、P210、P230阳性率与血清IL-6、IL-22、MCP-1水平均呈负相关关系(均P<0.05)。加速期、急变期CML患者融合基因BCR-ABL P190、P210阳性率均高于慢性期(均P<0.05)。结论:融合基因BCR-ABL(P190、P210、P230)对ALL及CML的鉴别诊断价值较高,可为CML患者病程判断提供参考依据。