CpG ODN B对鸡新城疫重组杆状病毒疫苗的免疫增强效应

目的:探究CpG ODN作为疫苗佐剂对鸡新城疫重组杆状病毒疫苗的免疫效果。方法:将CpG ODN B/P这2种类型的免疫佐剂分别与鸡新城疫重组杆状病毒载体疫苗BV-BXY-F混合后,以鼻腔免疫方式进行鸡体免疫,并进行攻毒保护实验,通过对鸡体的临床症状观察,以及检测免疫保护率、中和抗体水平、淋巴细胞增殖活性、细胞因子含量,分析各CpG ODN对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响。结果:BV-BXY-F+CpG ODN B免疫组鸡在免疫后42 d中和抗体效价最高,免疫保护率100%,中和抗体效价,sIgA、IgG、IgA、IFN-γ、IL-2、IL-4、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞含量较BV-BXY-F+CpG ODN P组分别提高了32.08%、8.44%、13.56%、23.71%、50.20%、132.97%、39.76%、38.43%、25.99%,且差异显著(P<0.05),与单独免疫组BV-BXY-F相比分别提高了13.71%、89.39%、10.41%、21.26%、159.17%、52.71%、237.84%、80.51%、75.57%。结论:CpG ODN B对增强鸡新城疫重组杆状病毒疫苗的免疫增强效果最好。

利用杆状病毒表达载体研制兽用重组疫苗的进展

利用杆状病毒表达载体研制兽用重组疫苗的进展罗满林，张林元，陈溥言，蔡宝祥（南京农业大学动物医学系）昆虫杆状病毒正受到人们的日益重视。这不仅因为它可以作为安全、有效、无害的生物防治剂，而且由于Ｓｍｉｔｈ和Ｓｕｍｍｅｒｓ［１］创立并发展起来的昆虫杆状病毒...

表达重组鸡新城疫病毒免疫原蛋白基因的研究

以 Ｎ Ｄ Ｖ Ｈ Ｎ 基因重组禽痘病毒载体与禽痘病毒转染液为材料，以载体质粒的 Ｌａｃ Ｚ报告基因为筛选标记，在含有 Ｘｇａｌ的培养基上筛选蓝色空斑的阳性重组子，对初次筛选到的蓝色空斑经过三轮蚀斑纯化（蓝斑形成率达９０％ 以上），得到了能稳定增殖的病毒子；再分别提取病毒子感染细胞、正常对照细胞基因组 Ｄ Ｎ Ａ， Ｂａｍ ＨⅠ酶切后，以 Ｄ Ｉ Ｇ 标记的探针进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交检测，发现重组病毒感染的细胞基因组 Ｄ Ｎ Ａ 在７ ｋｂ 处有一 Ｄ Ｎ Ａ 片段，能与 Ｈ Ｎ 特异性探针呈阳性反应，而对照细胞没有，从而利用 Ｌａｃ Ｚ报告基因、 Ｈ Ｎ 探针杂交检测，我们成功地筛选并获得了 Ｎ Ｄ Ｖ Ｈ Ｎ 基因重组禽痘病毒，为下一步的研究工作奠定了基础。

鸡同时接种重组禽流感病毒（H5＋H7）二价灭活疫苗和鸡新城疫活疫苗后30d内抗体动态研究

试验随机选择未接种过新城疫、重组禽流感病毒（H5＋H7）二价灭活疫苗且经检测体内未含相关抗体的健康鸡40只，随机分成4组：第1组（A组）接种鸡新城疫活疫苗，第2组（明）接种重组禽流感病毒（H5＋H7）二价灭活疫苗，第3组（c组）同时接种重组禽流感病毒（H5＋H7）二价灭活疫苗和鸡新城疫活疫苗，第4组（试验对照组）不接种任何疫苗，作为对照组，观察各组免疫副反应。在接种后7d、14d、21d、28d采血，用血凝抑制试验检测抗体动态。结果显示：接种后7dA组和C价组中新城疫抗体阳性率均能达到60％；14～28d新城疫抗体阳性率均能达到100％，A组和C组中同期抗体新城疫Log2均值之间比较差异均不显著；接种后7dB价组和C价组中禽流感病毒H7亚型和禽流感病毒H5亚型抗体阳性率均能达到70％，14d时禽流感病毒H7亚型和禽流感病毒H5亚型抗体阳性率均能达到100％；14d时B价组和C组中亚HI型抗体阳性率能达到国家规定的70％的标准。

表达高致病性H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组杆状病毒疫苗候选株的构建与免疫效果评估

为了有效防控H7N9亚型禽流感疫情,研制能够预防高致病性H7N9亚型禽流感的疫苗非常必要。研究基于昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS),构建并拯救了一株表达高致病性H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)的重组杆状病毒rBac-GD15HA。间接免疫荧光试验及免疫印迹试验鉴定结果表明rBac-GD15HA的HA蛋白在Sf9细胞中成功表达;重组病毒细胞传代试验结果表明rBac-GD15HA在传代过程中能保持较高的病毒滴度,且遗传稳定;鸡的免疫试验结果显示,重组疫苗在一次免疫后即能诱导较高水平的针对H7N9 AIV的抗体应答,并能提供针对高致病性H7N9 AIV 100%的临床保护。因此,研究结果可作为H7N9亚型禽流感疫苗研发策略的参考,为其防控提供一种安全有效的方法,也为今后广谱流感疫苗的研发奠定一定的基础。

猪瘟E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗在非典型猪瘟病例中的控制效果

猪瘟是由猪瘟病毒引起的高度接触性传染病最早发现于美国俄亥俄州。世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疫病名录,为必须申报的(Notifiable)动物传染病,我国也将其列为一类动物传染病[1]。该病在世界范围内流行,以流行范围广、发病率和致死率高为主要特征,给世界养猪业造成严重危害。近年来,猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势,一些已宣布消灭了猪瘟的国家(如法国、荷兰、德国等)又见猪瘟复发的报道[2]。

重组杆状病毒表达轮状病毒SA11毒株VP4蛋白

从培养的SA11病毒中提取病毒dsRNA作为模板，经逆转录、多聚酶链反应（RT-PCR）获得编码VP4蛋白的全基因，全长2362bp.完整的VP4基因克隆到杆状病毒转移载体pVL-1393中，转染Sf9细胞进行同源重组，用声、杂交法筛选出表达VP4蛋白的重组杆状病毒。表达的VP4蛋白能被抗轮状病毒抗体所识别，表达产量约占总蛋白的10％。用表达的VP4蛋白免疫动物后可产生高水平抗亲本SA11毒株中和抗体。抗体能阻断SA11病毒在MA104细胞上引起的细胞病变（CPE），免疫荧光和Westernblot也证实抗体可特异性识别轮状病毒抗原。结果表明，重组杆状病毒表达的VP4蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，可望用VP4基因研制轮状病毒重组疫苗和亚单位疫苗。

人乳头瘤病毒16L1/E7CTL重组杆状病毒载体的构建及鉴定

目的研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1/E7CTL重组杆状病毒载体。方法以包含HPV16标准病毒株的质粒pHPV16为模板,采用PCR技术扩增HPV16主要衣壳蛋白L1(1-471aa)的基因序列,同时人工合成E7蛋白CTL表位E749-57的编码序列,将两个目的基因逐步连接构建重组质粒pUC19HPV16L1/E7CTL,HPV16L1/E7CTL片段经质粒pFast Bac1转位至Bacmid DNA后通过PCR鉴定重组杆粒。结果成功构建了包含融合基因HPV16L1/E7CTL片段的克隆质粒pUC19HPV16L1/E7CTL,制备了L1/E7CTL重组杆状病毒载体杆粒BACMID DNA。结论采用分子克隆技术构建了包含L1/E7CTL的重组杆粒BACMID DNA,有利于下一步融合蛋白的表达,制备一种能够更有效激发CTL杀伤作用的嵌合病毒样颗粒疫苗,为疫苗研制打下基础。

杆状病毒疫苗载体的应用研究进展

人源病毒基因载体存在的记忆免疫和毒性阻碍了其在临床上的应用。自从发现杆状病毒能够有效进入多种哺乳动物细胞系和原代细胞后,其在基因治疗中的应用引人注目,候选杆状病毒载体迅速兴起。在哺乳动物细胞中,杆状病毒既不能复制也不能引起明显的细胞毒性作用,不存在哺乳动物病毒载体的相关记忆免疫。另外,含有新的穿梭启动子且包膜修饰的重组杆状病毒在体内的转导效率大幅度提高。在非人源病毒载体中,杆状病毒已成为新颖的令人瞩目的疫苗载体。

新型禽流感—新城疫重组二联活疫苗诱导雏鸡免疫效果初步探讨

为探讨新型禽流感一新城疫重组二联活疫苗在实践中的免疫效果，准确掌握抗体水平并制订出适合本城区家禽免疫程序，为防治高致病性禽流感和鸡新城疫疫病提供科学依据。采取点眼＋滴鼻及肌肉注射的方法对2000只健康雏鸡按照不同的免疫程序进行免疫，在45d龄，每组随机抽取20只采血检测血清中禽流感及新城疫的HI效价。

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。

一种新的鸡新城疫疫苗

最近研究人员应用DNA重组技术研制出一种新的新城疫疫苗。这种基因工程苗为消灭新城疫开辟了新的途径。新城疫病毒是副粘病毒属的一个成员,其病毒粒子衣壳上有两个主要的糖蛋白成分:一个叫血凝素神经氨酸苷酶(HN)蛋白,它使病毒能够吸附在细跑上,另一个叫融合(F)蛋白,它与细胞融合及病毒渗透进细胞中有关。F蛋白在疫病的免疫上起着重要的作用。

H5亚型禽流感病毒HA基因昆虫／杆状病毒系统的表达及对BALB/c小鼠的免疫保护

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1／96 H5N1亚型1．7kb HA基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序。亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA的蜜蜂蜂毒素分泌信号下游中,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染Sf9昆虫细胞。将重组杆状病毒感染HFive细胞,72h左右收获细胞,超声波裂解,SDS—PAGE结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得表达。蛋白胶薄层扫描分析显示:表达的HA蛋白占重组杆状病毒感染细胞总蛋白含量的17．1％。Western-blot 及血凝实验结果显示,表达的禽流感H5N1亚型病毒HA蛋白具有生物学活性。表达的H5 HA蛋白定量乳化后,皮下多点注射免疫SPF 级BALB/c雌性小鼠,免疫后产生了H5 HA特异抗体,并在三免前后达到并保持较高水平。用致死剂量的HPAIV H5N1攻击小鼠,免疫组小鼠提供了100％的保护力,而对照组小鼠先后发病且死亡:为研制禽流感H5N1亚型病毒亚单位疫苗,防制禽流感奠定了基础。

编码HIV-1 Pr42^(gag)的杆状病毒转移载体的构建及鉴定

本文作者采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ），从ＨＩＶ－１ｃＤＮＡ克隆ＢＨ１０中扩增出Ｐｒ４２ｇａｇ的基因片段，经适当的限制性内切酶消化后插入到杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ９中，使其处于多角蛋白启动子的控制之下，构成重组转移载体ｐＢａｃＧＡＧ４２。酶切鉴定结果与预期的一致。再用载体上多克隆位点两翼的引物对连接处进行序列分析，结果表明外源基因处于多角蛋白启动子的控制下，且成功地引入了起始码和终止码。

登革病毒重组蛋白表达及其亚单位疫苗研究进展

登革病毒(DV)为黄病毒属的重要成员,借蚊媒传播而引起登革热(DF)、登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS),其基因组全长约为10.7kb,编码有C-prM/M-E3个结构蛋白和7个非结构蛋白.

生物技术在新城疫疫苗研究上的应用

新城疫病毒(NDV)是副粘病毒科、副粘病毒属的原型病毒,亦称副粘病毒1型(APMV-1),属于不分节段的负极性单股基因组RNA病毒。它所引起的传染病——人兽共患新城疫(ND)至今仍是对世界养禽业危害和威胁最严重的病毒病之一。NDV是一种高度接触传染性病原,在小鸡、火鸡、鸽、鹤、鹌鹑和数种鸟群中能引起100％发病死亡。为此,国内外学者一直对ND防治研究给予高度重视。

动物疫病病毒样颗粒疫苗的研究进展

病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是由病毒结构蛋白组成的空心颗粒,具有天然病毒粒子形态和空间结构,但不含有病毒核酸,无感染能力,也不能自主复制[1-2]。许多病毒的结构蛋白在异源系统内重组表达即可自装配形成VLPs,这些VLPs的形态和结构与真正的病毒粒子相似,大小介于15 nm^400 nm,具有天然病毒粒子的空间构象和与天然病毒相似的免疫原性。

科研人员构建重组H7N9流感疫苗

最近,由H7N9流感病毒造成的人死亡病例使得有必要研制疫苗来预防H7N9流感。美国Novavax公司的科研人员构建了重组H7N9流感疫苗,该疫苗包括未经修饰的HA蛋白和NA蛋白来自A/Anhui/1/2013株,以及克隆入杆状病毒载体的M1蛋白（来自A/Indonesia/05/2005株）;感染昆虫细胞的杆状病毒可分泌由HA、NA和M1构成的病毒样颗粒。第0、14天,用A/Anhui/1/2013（H7N9）病毒样颗粒（VLP）疫苗免疫BALB/c小鼠致死模型以评估其免疫原性和免疫效力。

EV71病毒样颗粒疫苗:改进生产条件增加疫苗收量

为开发肠道病毒71（EV71）疫苗,我们先前构建了重组杆状病毒（Bac-P1-3CD）共表达EV71 P1（在多角体病毒启动子控制下）和3CD（在P10启动子控制下）蛋白。这些蛋白由3CD蛋白酶引起P1的分解,并在Sf-9细胞里自装配成病毒样颗粒（VLPs）。假定降低3CD的表达可减少在P1表达的竞争并提高VLPs的收率,因此我们构建了表达3CD的Bac-P1-C3CD和Bac-P1-I 3CD（分别受控于CMV和IE-1的弱启动子）。